Bir görüntüleme mikroplakasında önceden dökülmüş poli (etilen glikol) (PEG) hidrojeller kullanılarak vaskülarize osteojenik kemik iliği nişinin basit bir şekilde kurulması

Şekil 1’de aşağıdaki protokol bölümleri özetlenmektedir. 1. 3D stromal monokültürün kurulması hBM-MSC hücre süspansiyonunu hazırlayın.HBM-MSC’leri, 37 ° C’de bir inkübatörde% 10 FBS,% 1 penisilin-streptomisin ve 5 ng / mL FGF-2 ve nemlendirilmiş bir atmosferde% 5 CO2 ile desteklenmiş MEMa’da% 70-90’lık bir birleşme seviyesine yükseltin. Hücreler 6. pasaja kadar kullanılabilir. Hücreleri PBS ile yıkayın ve 37 ° C’de 3-5 dakika boyunca% 0.05 Tripsin-EDTA kullanarak ayırın. Bazal ortamla (MEMa% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) yıkayarak ayrılma işlemini durdurun. Asılı hücreleri 50 mL’lik bir konik santrifüj tüpünde toplayın. Bir hematositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve süspansiyondaki toplam hücre sayısını belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleme ile peletleyin. Supernatan’ı dikkatlice çıkarın. 1 x 107 hücre / mL stok çözeltisi konsantrasyonu elde etmek için hücreleri uygun bir bazal ortam hacminde yeniden askıya alın. İlgili büyüme faktörleri (FGF-2 ve BMP-2 gibi tanımlanmış konsantrasyonlarda, örneğin 0 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL veya 200 ng/mL) ile desteklenmiş gerekli bazal ortam hacmini içeren 50 mL konik santrifüj tüpleri hazırlayın. Kuyu başına 200 μL gereklidir. Hücre tohumlaması otomatik bir sıvı işleyici kullanılarak gerçekleştirilecekse, cihazın ölü hacmini de göz önünde bulundurun. Manuel hücre tohumlaması için,% 10’luk bir hacim fazlalığı yeterlidir. 1.5 x 105 hücre/mL’lik bir konsantrasyon elde etmek için hBM-MSC’leri stok çözeltisinden 1:66.67’lik bir seyreltmede ekleyin. Plakayı tohumlama için hazırlayın.96 delikli hidrojel plakayı kaplayan polipropilen yapışkan filmi çıkarın. Hidrojelleri kaplayan depolama tamponunu dikkatlice aspire edin. Bu görev için bir mikroplaka yıkayıcı kullanın; ancak, manuel kullanım mümkündür.Manuel aspiratör veya çok kanallı pipet kullanırken, ucu kuyunun duvarına yaslayın ve tamponu aspire ederken yavaşça iç kuyucuğun kenarına doğru hareket ettirin. Bu, hidrojel yüzeyine zarar vermekten kaçınacaktır. Otomatik plakalı bir yıkayıcı kullanırken, aspirasyon nozullarını plaka taşıyıcısından en az 3,8 mm uzağa (bu, hidrojel plakanın iç halkasından 0,8 mm’ye karşılık gelir) ve kuyunun kenarına doğru ayarlayın. Daha ayrıntılı talimatlar ve 96 delikli hidrojel plakanın plaka çizimlerini edinmek için üreticinin el kitabına bakın. Hücrelerin homojen olarak dağıldığından emin olmak için iyice karıştırdıktan sonra adım 1.1.7’de hazırlanan hücre süspansiyonunun 200 μL / kuyucuğunu ekleyin. Tohumlama sırasında, substratın bir bölgesindeki hücrelerin düzensiz çökelmesini önlemek için, plakayı eğmeyin. Manuel tohumlama için, karışımı homojen tutmak için hücre süspansiyonunu (üç kuyucuk tohumladıktan sonra) periyodik olarak karıştırın. Otomatik tohumlama için, eşit sayıda hücre içeren hacimleri dağıtmak için dağıtmadan hemen önce serolojik bir pipetle karıştırın. Kültürleri nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C ve% 5 CO2’de tutun. Kültürlerin gelişimini, istediğiniz gibi 5x hedefle parlak alan mikroskobu ile izleyin. Eklenen hücre sayısını değerlendirmek için tohumlamadan yaklaşık 30 dakika sonra referans görüntüler alın. 2. 3D stromal-endotelyal hücre ko-kültürünün oluşturulması GFP-HUVEC hücre süspansiyonunu hazırlayın.37 °C’de 30 dakika boyunca 0.02 M asetik asit içinde 150 μg / mL sıçan kuyruğu kollajen I’den oluşan bir çözelti ile kaplayarak HUVEC kültürü için şişeler hazırlayın. Kullanmadan önce PBS ile bir kez durulayın. GFP-HUVEC’leri EGM-2’de -0 birleşme seviyesine yükseltin, 37 ° C’de bir inkübatörde FBS ve nemlendirilmiş bir atmosferde %5 CO2 ile desteklenin. Hücreler 7. pasaja kadar kullanılabilir. Hücreleri PBS ile yıkayın ve 37 ° C’de 2-3 dakika boyunca% 0.05 Tripsin-EDTA kullanarak ayırın. Bazal ortamla (MEMa% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) yıkayarak ayrılma işlemini durdurun. Asılı hücreleri 50 mL’lik bir konik santrifüj tüpünde toplayın. Bir hematositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve süspansiyonda bulunan toplam hücre sayısını belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleme ile peletleyin. Supernatan’ı dikkatlice çıkarın. 1 x 107 hücre / mL stok çözeltisi konsantrasyonu elde etmek için hücreleri uygun bir bazal ortam hacminde yeniden askıya alın. Adım 1.1.6’da hBM-MSC’ler için açıklandığı gibi, ilgili büyüme faktörleri (FGF-2 ve BMP-2, örneğin 0 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL veya 200 ng/mL) ile desteklenmiş gerekli bazal ortam hacmini içeren 50 mL konik santrifüj tüpleri hazırlayın. GFP-HUVEC’leri, adım 1.1.7’de hBM-MSC’ler için açıklandığı gibi, 1,5 x 105 hücre/mL’lik bir konsantrasyon elde etmek için stok çözeltisinden 1:66,67’lik bir seyreltmede ekleyin. Ortamı, adım 1.2.2’de tampon çıkarma için açıklandığı gibi, stromal monokültürü içeren plakadan aspire edin. Adım 1.3’teki hBM-MSC ilavesi için açıklandığı gibi, adım 2.1.8’de hazırlanan GFP-HUVEC hücre süspansiyonunun 200 μL/kuyusunu ekleyin. Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C ve% 5 CO2’de inkübe edin. Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. İstediğiniz gibi 5x objektif kullanarak parlak alan ve floresan mikroskobu ile kültürün gelişimini izleyin. Kültürleri, sırasıyla erken veya ara karakterizasyonlar için veya istenildiği gibi ortak kültürün 4. veya 7. gününe kadar koruyun. 3. Karakterizasyon prosedürü 1: Endotel hücre ağı oluşumunun ölçülmesi İstenilen zaman noktalarında, GFP-HUVEC’lerden GFP sinyalini, niceleme için uygun ayarları kullanarak floresan mikroskobu ile elde edin (yani, daha büyük görüş alanları için en iyi odak, yüksek kontrast ve düşük büyütme [örneğin, 5x]). Kontrastı daha da artırmak için aynı gün elde edilen tüm görüntüleri eşit şekilde önceden işleyin (örneğin, Fiji32 kullanarak). GFP sinyalinin kültür zamanı ile daha sönük hale gelebileceğini unutmayın; Bu nedenle, farklı günlerde elde edilen görüntülerin farklı işlemlere ihtiyacı olabilir.Fiji veya ImageJ kullanıyorsanız, aynı zaman noktasındaki tüm GFP kanal görüntülerini açın ve Parlaklık ve Kontrast menüsünü açın. Bir ara koşulu temsil eden bir görüntü seçin (en sönük ve en parlak sinyal değil) ve Otomatik seçeneğini belirleyerek kontrastı otomatik olarak ayarlayın. Ayarla’yı seçin ve Diğer Tüm Açık Görüntülere Yay’ı işaretleyin. Otomatik olarak seçilen aralığın geçerli zaman noktasının tüm görüntülerine uyup uymadığını görsel olarak değerlendirin ve gerektiğinde tüm görüntülere manuel olarak yeniden ayarlayın ve yeniden yayınlayın. Ayarlanan görüntüleri TIF dosyaları olarak kaydedin ve alınan diğer zaman noktaları için adım 3.2.1 ve adım 3.2.2’yi tekrarlayın. Aşağı yönde yapı tanımayı önlemek ve böylece doğru ağ tanımlamasını kolaylaştırmak için tüm görüntülere bir medyan bulanıklık filtresi (ör. 2048×2048 görüntüler için yarıçap 3) uygulayın. Gruplama (2×2) yaparak boyutu küçültün ve önceden işlenmiş tüm görüntüleri niceleme için gri tonlamalı RGB Color TIF dosyaları olarak bir klasöre kaydedin. Bu adımlar, yazarların istek üzerine paylaşacakları makrolar kullanılarak manuel olarak veya toplu iş modunda yapılabilir. ImageJ33 için Anjiyogenez Çözümleyicisi’ndeki Toplu İşlem modunu kullanarak 3.1-3.3 adımlarında oluşturulan klasördeki tüm görüntüleri analiz edin. Görüntülerin boyutuna ve kullanılabilir çalışma belleğine bağlı olarak, bu işlemin görüntü başına birkaç dakika sürebileceğini unutmayın. Tanınan yapıların ve orijinal görüntülerin bindirmelerini inceleyerek niceleme sonuçlarını doğrulayın. Algoritma, orijinal görüntüde yalnızca birkaç hücrenin görülebildiği veya hiç görülmediği yapay yapıları tanırsa, ön işleme parametrelerini ayarlayın ve orijinal görüntüleri yeniden analiz edin veya bu tür sorunlu alanları hariç tutun ve / veya görüntüleri analizden çoğaltın. Her bir numunenin değerlerini, analiz edilen alanın 1mm2’ye oranı ile çarparak elde edilen değerleri 1mm2’lik bir alana normalleştirin. Bu adım, farklı boyutlarda görüntüler kullanılıyorsa özellikle önemlidir. Toplam ağ uzunluğu, kavşak sayısı, segment sayısı, izole segment sayısı, dallanma aralığı ve ortalama ağ boyutu gibi çeşitli ağ parametrelerini analizden çıkarın ve bunları endotel ağını farklı zaman noktalarında ve farklı kültür koşullarında karakterize etmek için kullanın. 4. Karakterizasyon prosedürü 2: ECM birikiminin değerlendirilmesi İstenilen bitiş zaman noktalarında, immünofloresan kullanarak ECM birikimini değerlendirin. Aşağıda açıklandığı gibi, kültürün son 6 saati boyunca veya fiksasyondan sonra kültür ortamının 100 μL’sinde çeşitli ECM moleküllerine karşı birincil antikorlar ekleyin.Kültürleri bir kez RT’de 5 dakika boyunca 200 μL / PBS kuyusu ile yıkayın ve RT’de 30 dakika boyunca kimyasal bir duman davlumbazının altında 100 μL / kuyu% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Sabit kültürleri RT’de her seferinde 5 dakika boyunca üç kez 200 μL / PBS kuyusu ile yıkayın ve 200 μL / PBS kuyusunda 4 ° C’de saklayın veya hemen bir sonraki adıma geçin. Fiksasyondan sonra ECM moleküllerine karşı primer antikorlarla inkübe etmeden önce, sabit kültürleri RT’de 30 dakika boyunca bloke edici bir çözelti olarak PBS’de 200 μL/kuyu% 1 BSA ile inkübe edin.Bloke edici çözeltiyi aspire edin ve PBS’de %1 BSA’da 100 μL/kuyu birincil antikor çözeltisi ile 4 °C’de bir gecede inkübe edin. RT’de sırasıyla 5 dakika, en az 3 saat ve 5 dakika boyunca üç kez 200 μL / PBS ile yıkayın.NOT: Uzun yıkama adımı, bağlanmamış antikorun hidrojelden tamamen difüzyonu için gereklidir. Hücre içi karşı boyalar da dahil olmak üzere ikincil boyama çözeltisinin penetrasyonunu kolaylaştırmak için, kültürlerin hücresel yoğunluğuna bağlı olarak, RT’de 30-90 dakika boyunca PBS’de% 0.3 Triton X-100 ve% 1 BSA kullanarak kültürleri geçirgenleştirin.NOT: Hücre içi moleküllerin antikor bazlı boyanması için, bu adım, adım 4.1.2’de açıklanan birincil antikor ile inkübasyondan önce gerçekleştirilmelidir. İlgili ikincil antikorları ve karşı boyaları içeren ikincil boyama çözeltilerini istediğiniz gibi hazırlayın (örneğin, DAPI gibi bir nükleer leke ve faloidin-rodamin gibi bir sitoiskelet boyası).PBS’de %0,1 Triton X-100, %1 BSA ve karşı boyalardan (örneğin, 1 μg/mL DAPI ve 1:4.000 faloidin-rodamin) oluşan bir boyama tamponu hazırlayın ve önerilen seyreltmelerde ilgili ikincil antikorları ekleyin. 100 μL/kuyucuk ikincil boyama çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 °C’de inkübe edin. Birincil antikor inkübasyonundan sonraki prosedüre benzer şekilde, RT’de sırasıyla 5 dakika, en az 3 saat ve 5 dakika boyunca üç kez 200 μL / kuyucuk PBS ile yıkayın. Yapıların 3D çözümlenmesi için, cam tabandan başlayarak 2,5 μm’lik bir z-adımıyla 500 μm’lik bir son yüksekliğe ulaşan konfokal yığınlar elde edin, 10x objektif ve 0,75x dijital zoom kullanın. Fiji’de GFP ve F-aktin sinyalinin 3B yeniden yapılandırılmasını oluşturmak için, bir kompozit oluşturmadan ve Fiji 3D Görüntüleyici’yi kullanarak yeniden yapılandırmayı oluşturmadan önce her kanalı ayrı ayrı eşikleyin. İmmün boyamalardan biriken ECM’nin görselleştirilmesi için, 5 μm’lik bir z adımı, 10x objektif ve 1.5x dijital yakınlaştırma ile 100 μm yüksekliğinde konfokal yığınlar elde edin. Maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun ve bir kompozit oluşturmadan önce Fiji’de her kanal için parlaklığı ve kontrastı ayrı ayrı ayarlayın. Hücre dışı ortamın doğrudan renk lekelerini gerçekleştirin.Paraformaldehit ile sabitlenmiş kuyucuklara 200 μL / kuyu Picrosirius Kırmızı boyama çözeltisi ekleyin ve RT’de 1 saat inkübe edin. Daha sonra, lekeli kuyucukları damıtılmış suyla beş kez yıkayın, ardından numune renk temizliğini izlerken 3-4 gün boyunca günde iki kez veya her iki günde bir yıkayın. Uzun yıkama adımları sırasında plakaları 4 ° C’de tutun (yani, 6 saati aşan herhangi bir şey). Renkli bir kamerayla donatılmış parlak alan mikroskobu kullanarak lekeli örneklerin görüntülerini elde edin ve koşullar arasında eşit beyaz dengesini koruyun. Numunelerin genel bakışını elde etmek için, tüm kuyucuğu taramak üzere düşük bir büyütme oranı (ör. 2,5x) kullanın. Mikroskop otomatik dikişi destekleyen bir yazılımla birlikte gelmiyorsa, manuel olarak yapın (örneğin, Fiji34’te Çift Yönlü Dikiş kullanarak).NOT: Daha önce immünofloresan için kullanılan kuyucuklar, floresan görüntü alımının tamamlanması koşuluyla bunun için kullanılabilir. Alizarin Kırmızısı boyama, yıkama ve görüntüleme işlemlerini gerçekleştirmek için 4.2.1-4.2.3 adımlarında Picrosirius Kırmızı boyama için açıklanan adımları izleyin. 5. Karakterizasyon prosedürü 3: ALP aktivitesini izleyerek osteojenik farklılaşmanın değerlendirilmesi Farklı kültür bitiş zaman noktalarında (örneğin, ko-kültürün 4. günü ve 7. günü), 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP) / nitro mavi tetrazolyum (NBT) boyaması kullanarak ALP aktivitesini kantitatif olarak değerlendirin.Üreticinin talimatlarını izleyerek hazırlanması gereken BCIP/NBT substrat çözeltisi ile inkübe etmeden önce kültürleri 200 μL/kuyucuk PBS ile bir kez yıkayın. Renk gelişimini periyodik olarak izlerken 37 ° C’de inkübe edin. Renk osteojenik olmayan koşullarda gelişmeye başladığında, adım 4.1.1’de açıklandığı gibi% 4 paraformaldehit ile sabitlemeden önce hemen 200 μL / PBS kuyusu ile bir kez yıkayın. Picrosirius Kırmızı boyama için adım 4.2.3’te açıklandığı gibi lekeli örneklerin renkli görüntülerini alın. Farklı kültür bitiş zaman noktalarında (örneğin, ortak kültürün 4. günü ve 7. günü), hücre lizatlarındaki ALP aktivitesini ölçün.37 ° C’de 200 μL / % 0.25 Tripsin-EDTA kuyusu ile inkübe etmeden önce kültürleri 200 μL / PBS kuyusu ile üç kez yıkayın. Her 10 dakikada bir, sindirimi kolaylaştırmak için yukarı ve aşağı kuvvetli bir şekilde pipetleyerek kültürleri çalkalayın ve standart bir hücre kültürü mikroskobu ile kültür morfolojisini izleyin. Kuyucuklarda uzun hücresel yapılara sahip olmayan sıvı, tek hücreli bir süspansiyon elde edildikten sonra (tipik olarak 20-30 dakika sonra), numuneleri 2 mL tüplere aktarın, Tripsin’i inhibe etmek için 200 μL MSC bazal ortam ekleyin ve alınan hücreleri pelet haline getirmek için 5 dakika boyunca 500 x g’de santrifüj yapın. Süpernatanı boşaltın ve peletleri -80 ° C’de dondurun veya doğrudan adım 5.2.3’e geçin. Adım 5.2.2’de elde edilen hücre peletlerini çözün ve buz üzerinde 30 dakika boyunca 0.56 M 2-Amino-2-metil-1-propanol,% 0.2 Triton X-100, pH 10’dan oluşan 500 μL lizis tamponu ile inkübe edin. Daha sonra, 4 ° C’de 10 dakika boyunca 16.100 x g’de santrifüj yapın ve numuneleri buz üzerinde tutun. Adım 5.2.7’de açıklanan ölçümlerden sonra, numuneleri -20 ° C veya -80 ° C’de dondurun veya adım 5.2.8’de açıklandığı gibi doğrudan DNA nicelemesine devam edin.NOT: Lizis tamponu önceden hazırlanabilir, steril filtrelenebilir ve 4 °C’de saklanabilir. Lizis tamponunda 20 mM, 4-Nitrofenil fosfat, disodyum tuzu, hekzahidrat ve 4 mMMgCl2’den oluşan ALP reaktifini hazırlayın.NOT: Bu çözeltiyi niceleme gününde taze olarak hazırlamak en iyisidir. Herhangi bir peletlenmiş kalıntıyı rahatsız etmeden, adım 5.2.3’te hazırlanan hücre lizat süpernatantının 50 μL’sini, standart, şeffaf, doku kültürü 96 delikli bir plakanın kuyucuklarına kopyalar halinde dağıtın. Lizis tamponunu boş kontroller olarak iki kuyucuğa ekleyin. Çok kanallı pipetle, adım 5.2.5’te doldurulan kuyucuklara 50 μL/kuyucuk ALP reaktifi ekleyin. Plakayı kısaca çalkalayın ve ışıktan korunan 10 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin. ALP aktivitesi daha yüksek olan kuyular sarı görünecektir. Çok kanallı pipet kullanarak 100 μL/kuyucuk 1 M NaOH ekleyerek reaksiyonu durdurun. Bir plaka okuyucu kullanarak optik yoğunluğu 410 nm’de okuyun. Teknik kopyaların ortalamasını alın ve boş denetimlerin ortalamasını çıkarın. Önceki adımlarda belirlenen ALP aktivitesini toplam hücre sayısına karşı normalleştirmek için DNA nicelleştirmesi yapın. Burada, floresan ölçümlerine dayanan bir yöntem açıklanmaktadır, ancak hücre lizatlarında DNA niceliği için başka herhangi bir yöntem tahlil ile uyumludur. DNA nicelemesi için gerekli reaktifleri ve DNA standartlarını, üreticilerin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak hazırlayın.NOT: DNA standartlarının hazırlanmasında lizis tamponunun kullanılması önerilir. Adım 5.2.3’te açıklanan ALP ölçümü için kullanılan numuneler dondurulmuşsa, bunları çözün, 4 ° C’de 2 dakika boyunca 16.100 x g’de santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Herhangi bir pelet döküntüsünü rahatsız etmeden, hücre lizat süpernatantının 50 μL’sini siyah 96 delikli bir plakanın kuyucuklarına kopyalar halinde dağıtın. Numuneleri -20 °C veya -80 °C’de dondurun ve gerekirse ALP ve DNA nicelemelerini tekrarlayın. DNA standartlarını kopyalar halinde ekleyin. Çok kanallı pipetle, 50 μL DNA boyama maddesi ekleyin, inkübe edin ve üreticinin talimatlarına göre floresan yoğunluğunu okuyun. Standart eğri değerlerini kullanarak, ölçülen yoğunluk değerlerinin DNA konsantrasyonlarına dönüşümünü belirleyin ve uygulayın. Adım 5.2.7’de elde edilen ALP değerlerini, her bir numunenin ilgili DNA konsantrasyonuna bölerek normalleştirin. 6. Uygulama 1: İlaç duyarlılık tahlillerinin yapılması Endotel ağları tamamen geliştiğinde (tipik olarak stromal-endotelyal hücre ko-kültürlerinin 4. gününde), taze kültür ortamındaki kültürlere bevacizumab gibi anti-anjiyojenik bileşikler ekleyin ve aktivitelerini zaman içinde ve farklı koşullar altında test edin (örneğin, farklı FGF-2 veya BMP-2 konsantrasyonları).Bu noktaya kadar ilgili kültürler için kullanılan aynı büyüme faktörlerini içeren taze kültür ortamı hazırlayın.İlgili bileşiğin seyrelticinden oluşan bir kontrol çözeltisi hazırlayın (örneğin, bevacizumab için: 60 mg / mL α-trehaloz dihidrat, 0.4 mg / mL Tween20, 5.8 mg / mL sodyum fosfat, monobazik ve monohidrat ve 1.2 mg / mL sodyum fosfat dibazik, susuz) ve steril filtreleyin. İlgili bileşiği istenen konsantrasyonda (örneğin, 10 μg / mL bevacizumab) ve kontrol çözeltisinin eşit hacmini, sırasıyla test ve kontrol koşulları için belirlenen kültür ortamına ekleyin. Ortamı kültürden aspire edin ve adım 6.1.1’de taze hazırlanmış ortamın 200 μL / kuyusunu ekleyin. Test edilecek bileşik için uygun bir süre boyunca inkübe edin (örneğin, bevacizumab için: 2 gün). Kültür gelişimini izleyin ve endotel ağlarını bölüm 3’te açıklandığı gibi karakterize edin. GFP görüntülerini ve adım 3.7’de açıklanan analizden çıkarılan kantitatif ağ parametrelerini kullanarak bileşiğin anjiyogenezi inhibe etmede veya önceden oluşturulmuş yapıları ablatlamadaki etkinliğini değerlendirin. 7. Uygulama 2: Çeşitli kanser hücresi tipleri ile gelişmiş ko-kültür sistemlerinin kurulması Ko-kültürün 4. gününde, endotel ağları çoğunlukla kurulduğunda, taze kültür ortamındaki kültürlere MDA-MB-231 veya U2OS kanser hücreleri gibi diğer hücre tiplerini ekleyin.Kanser hücrelerini, GFP etiketli HUVEC’lerden ve ortak kültürlerdeki etiketli olmayan hBM-MSC’lerden ayırt edebilmek için üreticinin talimatlarına göre hücre uyumlu bir canlı boya kullanarak etiketleyin. Bu noktaya kadar ilgili kültürler için kullanılan aynı büyüme faktörlerini içeren taze kültür ortamında 1.5 x 104 hücre / mL konsantrasyonunda kanser hücrelerinin bir süspansiyonunu hazırlayın. Kültür gelişimini ve kanser hücresi lokalizasyonunu istediğiniz gibi izleyin.NOT: Kanser tipine, aktivitesine ve çevresine bağlı olarak, stromal-endotel hücre ko-kültürlerinde vasküler yapılara ulaşmaları birkaç gün sürebilir (örneğin, MDA-BM-231 ve U2OS için 2 gün). Bu nedenle, kanser-vasküler hücre etkileşimlerini görselleştirmek için hızlandırılmış görüntüleme buna göre zamanlanmalıdır.