Модель сосудистой ниши костного мозга in vitro создается путем посева мезенхимальных и эндотелиальных клеток на предварительно отлитые 3D-гидрогели ПЭГ. Эндотелиальные сети, компоненты ECM и активность ALP в нишах варьируются в зависимости от используемого фактора роста. Платформа может быть использована для продвинутых моделей рака.
Кость и костный мозг являются высоко васкуляризированными и структурно сложными органами и являются местами образования рака и метастазов. Крайне желательны модели in vitro , воспроизводящие специфические функции костей и костного мозга, включая васкуляризацию, которые совместимы с скринингом лекарств. Такие модели могут преодолеть разрыв между упрощенными, структурно нерелевантными двумерными (2D) моделями in vitro и более дорогими, этически сложными моделями in vivo . В этой статье описывается контролируемый трехмерный (3D) анализ совместной культуры на основе инженерных матриц из поли (этиленгликоля) (ПЭГ) для создания васкуляризированных остеогенных ниш костного мозга. Матричная конструкция PEG позволяет разрабатывать 3D-клеточные культуры с помощью простого этапа посева клеток, не требующего инкапсуляции, что позволяет разрабатывать сложные системы совместного культивирования. Кроме того, матрицы прозрачны и предварительно отлиты на 96-луночные пластины со стеклянным дном, что делает систему пригодной для микроскопии. Для анализа, описанного здесь, сначала культивируют мезенхимальные стромальные клетки, полученные из костного мозга человека (hBM-MSCs), до тех пор, пока не будет сформирована достаточно развитая сеть 3D-клеток. Впоследствии добавляются GFP-экспрессирующие эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Развитие культуры сопровождается светлопольной и флуоресцентной микроскопией. Наличие сети hBM-MSC поддерживает образование сосудистых структур, которые в противном случае не сформировались бы и остаются стабильными в течение как минимум 7 дней. Степень образования сосудистой сети может быть легко определена количественно. Эта модель может быть настроена на остеогенную нишу костного мозга путем дополнения питательной среды костным морфогенетическим белком 2 (BMP-2), который способствует остеогенной дифференцировке hBM-МСК, оцениваемой по повышенной активности щелочной фосфатазы (ЩФ) на 4-й и 7-й день совместной культуры. Эта клеточная модель может быть использована в качестве платформы для культивирования различных раковых клеток и изучения того, как они взаимодействуют с сосудистыми нишами, специфичными для костей и костного мозга. Кроме того, он подходит для автоматизации и анализа с высоким содержанием, что означает, что он позволит проводить скрининг лекарств от рака в условиях культуры с высокой воспроизводимостью.
Кость и костный мозг являются структурно и функционально сложными органами, занимающими центральное место в здоровье человека. Это отражается в существовании отдельных ниш, которые регулируют кроветворение и поддержание костной ткани1. В настоящее время широко признано, что в здоровом костном мозге поддержание и расширение гемопоэтических и скелетных стволовых клеток, а также их потомства контролируется отдельными нишами. Эти ниши включают различные типы клеток, включая остеолинейные клетки, мезенхимальные стволовые клетки, эндотелиальные и периваскулярные клетки, нейрональные и глиальные клетки, адипоциты, остеокласты, макрофаги и нейтрофилы2. Неудивительно, что эти в основном сосудисто-ассоциированные ниши также участвуют в развитии различных типов лейкемии3 и являются местом метастазирования различных видов рака4. Из-за своей специфической роли в формировании кости, ремоделировании и поддержании кости (костного мозга) сосудистая сеть, связанная с костью, имеет различные специализированные структуры, отличные от сосудистой сети, обнаруженной в других частях тела 5,6,7. Таким образом, антиангиогенные или сосудисто-модулирующие препараты, применяемые системно, могут оказывать различное действие в этих специализированных средах8. Поэтому очень желательны модели для исследования молекулярных механизмов, участвующих в поддержании физиологических свойств кости и костного мозга, регенерации костей и костного мозга, а также реакции на терапевтическое лечение.
Классические двумерные (2D) тканевые культуры и исследования in vivo с использованием животных моделей дали бесценное представление о роли различных клеток и молекулярных игроков, участвующих в развитии кости и костного мозга 9,10. Модели, которые позволяют проводить высокопроизводительные эксперименты с соответствующими клетками человека, могут улучшить наше понимание того, как модулировать выбранные параметры в этих очень сложных системах.
В последнее десятилетие для создания 3D-моделей тканей использовались принципы, полученные с помощью тканевой инженерии11,12. Они в основном основывались на инкапсуляции тканезависимых клеток в биоматериалы для создания 3D-моно- или кокультур13. Среди наиболее часто используемых биоматериалов – фибрин14, коллаген 15 и матригель16,17, все из которых обладают высокой биосовместимостью и обеспечивают соответствующие условия для роста многих типов клеток. Эти биоматериалы обладают способностью генерировать модели in vitro, которые повторяют ключевые аспекты различных сосудистых ниш, обнаруженных in vivo18. Кроме того, использование микрофлюидных устройств для создания перфузированных моделей сосудистой кости и костного мозга способствовало созданию моделей in vitro более высокой сложности 19,20,21,22.
Сложность контроля состава и инженерных свойств встречающихся в природе биоматериалов вдохновила на разработку синтетических аналогов, которые могут быть рационально спроектированы с предсказуемыми физическими, химическими и биологическими свойствами23,24. Мы разработали полностью синтетические сшитые гидрогели на основе сшитого поли(этиленгликоля) (ПЭГ) фактора XIII (FXIII), которые функционализированы пептидами RGD и сайтами расщепления матриксной металлопротеазы (MMP) для облегчения прикрепления и ремоделирования клеток25,26. Модульная конструкция этих биоматериалов успешно использована для оптимизации условий формирования 3D васкуляризированных моделей костей и костного мозга27,28.
Для тестирования большего количества различных условий культивирования и новых терапевтических средств требуются модели с более высокой пропускной способностью. Недавно мы показали, что сшивание FXIII нашего гидрогеля ПЭГ можно контролировать с помощью электрохимического процесса, так что образуется углубленный градиент жесткости гидрогеля29. Когда клетки добавляются поверх таких гидрогелей, они мигрируют внутрь и постепенно превращаются в тесно взаимосвязанные3D-сотовые сети 30. Устранение необходимости инкапсулировать клетки в гидрогель, который обычно присутствует с другими 3D-каркасами, не только упрощает экспериментальный дизайн, но и позволяет последовательно добавлять различные типы клеток в разные моменты времени для создания сложных систем совместного культивирования. Эти гидрогели доступны в предварительно отлитом виде на 96-луночные пластины со стеклянным дном, что позволяет создавать 3D-культуры как вручную, так и с помощью автоматизированных протоколов посева клеток. Оптическая прозрачность гидрогелей ПЭГ делает платформу совместимой с микроскопией.
Здесь мы представляем простой метод создания и характеристики васкуляризированных остеогенных ниш в рамках этой готовой к использованию синтетической платформы plug-and-play. Показано, что развитие сосудистых сетей может быть стимулировано фактором роста, обычно используемым для индукции остеогенеза in vitro, костным морфогенетическим белком-2 (BMP-2), в то время как остеогенная дифференцировка может быть предотвращена добавлением фактора роста фибробластов 2 (FGF-2)27,31. Сформированные сети отличаются по сравнению с FGF-2-стимулированными сетями с точки зрения общего внешнего вида, а также распределения ячеек и ECM. Кроме того, мы контролировали остеогенную индукцию, используя щелочную фосфатазу в качестве маркера. Мы демонстрируем повышенную экспрессию этого маркера с течением времени и сравниваем экспрессию с таковой в стимулированных сетях FGF-2 с использованием качественных и количественных методов. Наконец, мы демонстрируем пригодность сгенерированных ниш этой модели для двух потенциальных применений. Во-первых, мы провели экспериментальный анализ чувствительности к лекарственным средствам, добавив бевацизумаб в предварительно сформированные ниши и отслеживая деградацию сосудистых сетей в его присутствии. Во-вторых, мы добавили клетки рака молочной железы MDA-MB-231 и остеосаркомы U2OS в предварительно сформированные остеогенные ниши, показывая, что ниши могут быть использованы для изучения взаимодействия между раковыми клетками и окружающей их средой.
Здесь мы описываем протокол для создания in vitro модели высоковаскуляризированных ниш кости и костного мозга в полностью синтетической и контролируемой матрице на основе 3D PEG, которая имеет множество применений в исследованиях биологии костей и костного мозга, тканевой инженерии и исследованиях рака. Эта модель основана на синтетическом гидрогеле на основе ПЭГ, который функционализирован пептидами RGD и участками расщепления MMP и отлит с углубленным градиентом плотности на 96-луночных пластинах30 для визуализации со стеклянным дном. Было показано, что эта платформа plug-and-play позволяет создавать тесно взаимосвязанные 3D-сотовые сети без необходимости инкапсуляции клеток в гидрогель. Подобно ранее описанному протоколу инкапсуляции клеток, в этой работе мы показываем ремоделирование субстрата с помощью присущего клетке ECM28 для создания микроокружения, специфичного для клеточного типа. Таким образом, с помощью этого метода скрининговые анализы лекарств и анализы с высоким содержанием могут быть легко выполнены в высоковоспроизводимых органотипических условиях 3D-культивирования. 96-луночные пластины со стеклянным дном и оптически прозрачные гидрогели делают платформу совместимой с автоматизацией работы с жидкостями и высокопроизводительной микроскопией.
Первым шагом в создании остеогенной сосудистой ниши костного мозга является предварительное культивирование hBM-МСК на гидрогеле ПЭГ в течение не менее 3 дней. За это время они прикрепляются к гидрогелю, проникают в него и начинают устанавливать межклеточные контакты и осаждение ECM. Перед посевом hBM-MSC буфер хранения должен быть удален. Поскольку гидрогель находится внутри внутреннего отверстия в стандартной лунке 96-луночной пластины для визуализации, можно безопасно вставлять аспирационный наконечник вдоль боковой стороны лунки до тех пор, пока он не коснется внутреннего кольца лунки. Вакуумный насос можно использовать для аспирации, если он установлен на минимально возможную силу всасывания. В качестве альтернативы для аспирации буфера из гидрогелевой пластины можно использовать автоматическую пластинчатую мойку с высотой сопла, отрегулированной, по меньшей мере, на 0,8 мм над внутренним колодезным кольцом. Использование автоматизации для работы с жидкостями может свести к минимуму повреждение поверхности гидрогеля и привести к более высокой воспроизводимости получаемых культур. Небольшие дефекты на поверхности гидрогеля становятся видимыми, как только клетки оседают на гидрогеле и появляются на более низкой плоскости фокуса в дефектных областях гидрогеля. Таким образом, получение эталонных изображений в день 0 служит хорошим контролем качества однородности засева клеток и целостности поверхности гидрогеля. В то время как небольшие дефекты поверхности гидрогеля не препятствуют дальнейшему использованию лунки, клетки имеют тенденцию группироваться на дефектных участках и могут превращаться в нерепрезентативные узоры или быстрее достигать нижнего стекла, где они превращаются в монослой. Эти артефакты должны быть отмечены при использовании/оценке этих скважин. Аналогичные соображения применимы к любым изменениям среды, выполняемым в течение всего периода анализа.
Второй этап протокола включает добавление GFP-HUVEC к предварительно сформированной монокультуре hBM-MSC (день 0 совместной культуры). ECM, депонированный hBM-MSC, обеспечивает отличный каркас для роста эндотелиальных клеток, которые в этой работе, даже в присутствии среды, кондиционированной hBM-MSC, могли образовывать только круглые клеточные кластеры на гидрогелях (не показаны). При посеве на культуры hBM-MSC HUVEC интегрируются и образуют микрососудоподобные структуры, сравнимые с теми, которые наблюдаются в кокультурах, полученных путем инкапсуляции клеток27,28. Как правило, хорошо развитые 3D-микрососудистые сети образуются в течение 4 дней после совместного культивирования, и это можно продольно контролировать с помощью GFP-меченных HUVEC. Эти структуры могут поддерживаться в течение не менее 7 дней в культуре, что означает, что есть достаточно времени, чтобы следить за изменениями в организации сосудистой сети в ответ на лечение, например, для скрининга антиангиогенных препаратов. Морфологические элементы эндотелиальной сети могут быть количественно определены в пакетном режиме путем сегментации изображений GFP с использованием хорошо зарекомендовавших себя инструментов, таких как плагин Angiogenesis Analyzer ImageJ33, и их параметры могут быть использованы для оценки, например, эффективности лекарственного средства и фармакодинамики.
Одним из существенных преимуществ описанной клеточной модели для многих потенциальных применений является ее пластичность. Простое дополнение питательной среды различными факторами роста может изменить внешний вид совместной культуры. Например, присутствие BMP-2 на протяжении всего периода моно- и кокультуры создает остеогенную сосудистую нишу, демонстрирующую повышенную активность ЩФ, внеклеточное отложение кальция, а также сборку и осаждение ECM. Напротив, в присутствии FGF-2 остеогенные маркеры отсутствуют, и кокультура образует меньше латеральных клеточных ассоциаций, но показывает более выраженный рост 3D-клеток. Тот факт, что FGF-2 подавляет активность ЩФ, в то время как БМП-2 вызывает более сильную активность ЩФ по сравнению с отсутствием лечения фактором роста, согласуется с предыдущими наблюдениями27. Тем не менее, несмотря на эти большие различия в стромальном компоненте hBM-MSC, протяженность микрососудистой сети была очень похожа для двух состояний, обработанных фактором роста в этой работе. В контрольных культурах образовалось лишь несколько коротких сосудистых сетей, представляющих, возможно, плохо васкуляризированную нишу костного мозга. Это говорит о том, что, просто изменив тип, концентрацию и время добавления факторов роста в культуральную среду, можно получить ряд четко определенных васкуляризированных ниш костного мозга, которые потребуются для сравнительных исследований. Однако для обеспечения воспроизводимых результатов важно отметить, что прогрессирование и морфология культуры могут варьироваться в зависимости от истории используемых клеток (например, номера прохода и метода отслойки, используемого во время рутинного поддержания культуры), и рекомендуется контролировать такие факторы во время дизайна анализа.
Здесь, в качестве первого применения этой модели, мы демонстрируем чувствительность сконструированных микрососудистых сетей к лечению бевацизумабом 10 мкг/мл. Примечательно, что важно подтвердить, что используемый алгоритм может точно распознавать эндотелиальную сеть, поскольку артефакты часто генерируются на изображениях со слабо развитыми сетями. В этом случае параметры, используемые для обработки изображений (до и во время сегментации), должны быть точно настроены, часто методом проб и ошибок.
В качестве второго приложения мы представляем продвинутую модель совместной культуры, образованную последовательным посевом мезенхимальных, эндотелиальных и раковых клеток. Эта модель позволяет изучать взаимодействия между раковыми клетками, стромой и сосудистой сетью костного мозга, которые могут быть важными факторами во время метастазирования. Кроме того, эта модель может быть использована для скрининга лекарств и тестирования соединений с мишенями, выходящими за рамки ангиогенеза.
В 2D-культурах клетки не получают физиологических сигналов микросреды, не приобретают естественную клеточную морфологию и, следовательно, дифференцируются по-разному по сравнению с клетками в нативных3D-средах 35. При выращивании в инженерных 3D-гидрогелях клетки на ранней стадии депонируют врожденный ECM, который обеспечивает места адгезии и может быть активно реконструирован28,36. Здесь, чтобы создать упрощенную 3D-модель для скрининговых приложений, сосудообразующие клетки были высажены на поверхность инженерных гидрогелей и позволили создать сосудистые сети при отсутствии перфузии. Оценки на основе визуализации проводились на 2D-проекциях эндотелиальных клеток, вносящих вклад в сосудистые структуры. Однако только конфокальные изображения выявили менее выраженное врастание 3D-сосудистых сетей в образцах, стимулированных BMP-2, по сравнению с образцами, стимулированными FGF-2. Это говорит о том, что длина сформированных сосудистых структур была недооценена, в то время как их связность была завышена. Кроме того, взаимодействие между периваскулярными и эндотелиальными клетками и образованием сосудистого просвета не исследовалось. Эти аспекты, особенно с точки зрения ответных мер по лечению наркомании, потребуют дальнейшего внимания. Наконец, было бы желательно усовершенствовать протоколы, позволяющие сначала создавать обширные 3D-сосудистые сети и только затем индуцировать их остеогенную дифференцировку для создания более физиологических моделей костей и костного мозга.
В целом, представленная здесь модель очень универсальна и может быть легко адаптирована к конкретным приложениям. Например, можно использовать мезенхимальные и эндотелиальные клетки из разных источников. Известно, что МСК жировой ткани и МСК пуповины экспрессируют различные ангиогенные факторы по сравнению с БМ-МСК, и они могут быть легко замещены в качестве альтернативного стромального компонента37. Эндотелиальные клетки, выделенные из уже определенных ниш костного мозга, также могут быть использованы вместо HUVEC. Можно также установить совместную культуру с полученными от пациента, соответствующими мезенхимальными и эндотелиальными клетками костного мозга для применения в персонализированной медицине, как недавно было предложено для васкуляризированных мышечных кокультур38. Кроме того, конструкция гидрогелевой пластины позволяет проводить продольный мониторинг культуры как с помощью светлопольной, так и с флуоресцентной микроскопии, что дает пользователю возможность сократить или продлить время культивирования в зависимости от применения. В качестве альтернативы, плотность клеток, используемых для посева, может быть соответствующим образом скорректирована для ускорения или задержки формирования клеточной сети, если требуется более короткое или более длительное время наблюдения, чем указано в этом протоколе. В любом случае, необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать разрастания клеток в листовидные структуры, что может привести к сокращению гидрогеля и, в конечном итоге, к отслоению клеток.
Наконец, с использованием этой модели можно проводить широкий спектр анализов. В дополнение к иммунофлуоресценции и микроскопии, выполняемым в живых или фиксированных культурах, 3D-культуры могут быть ферментативно переварены, а клетки могут быть извлечены и подвергнуты любому типу биохимического анализа. Здесь мы демонстрируем определение активности ALP и количественное определение содержания ДНК в лизатах клеток с помощью колориметрических/флуорометрических анализов, но система совместима со многими другими методами, включая ПЦР, РНК-секвенирование и протеомику. Если чувствительность желаемого анализа не очень высока, можно объединить образцы из более чем одной лунки, чтобы увеличить количество образца, доступного для анализа. Если желаемое применение требует более быстрого растворения геля, орбитальное встряхивание пластины может быть применено в сочетании с меньшими объемами пищеварительного раствора для обеспечения образования вихрей в лунках, предполагая, что все лунки на пластине будут использоваться таким образом (живые культуры чувствительны к такому жесткому обращению). Таким образом, мы представляем здесь протокол, который, если он используется, как описано, гарантирует создание модели in vitro , которая повторяет ключевые аспекты остеогенных сосудистых ниш, но также достаточно универсальна, чтобы ее можно было модифицировать для индивидуальных применений.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Риккардо Урбана за техническую помощь с устройствами для обработки жидкостей и Роди Одабаси за поддержку в проведении эпифлуоресцентной микроскопии. Эта работа финансировалась Швейцарским национальным научным фондом (гранты No 310030E_202429 и 205321__204318) и Ectica Technologies AG.
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
BSA | AppliChem | A1391 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
FBS | Gibco | 10500-064 | |
FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
hBM-MSCs | – | – | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
MDA-MB-231 breast cancer cell line | – | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
MEMα | Gibco | 22571-038 | |
Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
Multimode imaging reader – fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
PBS | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween20 | AppliChem | A4974 | |
U2OS osteosarcoma cell line | – | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |