Onderhouden en beoordelen van verschillende weefsel- en celtypes van het oog met behulp van een nieuw pomploos fluïdisch systeem

Alle procedures voor het oogsten van weefsel van ratten en muizen zijn goedgekeurd door de University of Washington Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Pre-experimentele voorbereiding OPMERKING: De volgende taken moeten ten minste een dag voor het experiment worden voltooid. Ontwerpen van het experimentele protocol Toewijzing van weefselplaatsing in kanalen: Kies een weefsel- of celmodel dat in 3 van de 4 kanalen aan elke kant van de MRM moet worden geplaatst. Aan elke kant wordt één weefselkamer gebruikt zonder weefsel dat kan worden gebruikt voor basislijncorrectie. Rangschik de monsters met behulp van een van de twee typische ontwerpen – verschillende protocollen voor testverbindingen aan elke kant (bijv. kanalen aan de ene kant van de MRM ontvangen testverbindingen terwijl de kanalen aan de andere kant als controle fungeren); hetzelfde injectieprotocol voor testverbindingen aan beide zijden van de MRM, maar verschillende weefsels of weefselmodellen versus controle aan weerszijden van de MRM. Selectie van debiet en weefselhoeveelheid voor optimale OCR-meting: Pas het debiet aan totdat de verandering in levensduurverhouding maal 100 ongeveer 3 is.OPMERKING: Typische hoeveelheden weefsel en bijbehorende stroomsnelheden worden weergegeven in tabel 1 voor componenten van het oog, waar het instrument het beste functioneert bij stroomsnelheden tussen 6-80 μL/min/kanaal. Berekening van het vereiste media/buffervolume: Bereken het volume van de media die aan het begin van het experiment aan elk MRM-inzetstuk moet worden toegevoegd alsVolumeMRM = 30 ml + duur van het protocol (in min) x debiet (in ml/min) x 4 kanalen (Eq.1)Bijvoorbeeld, bij 0,01 ml/min zal een 60 ml startvolume MRM een 12,5 uur protocol mogelijk maken (waarbij 30 ml zal worden uitgeput, terwijl 30 ml zal overblijven), terwijl bij 0.04 ml/min, 90 ml startvolumeMRM een 6 uur protocol mogelijk zal maken (met 30 ml overblijvend). Injectieprotocol voor testverbindingen: Selecteer de testverbindingen om te beoordelen, de te testen concentratie (meestal gekozen om een bijna maximale respons op te leveren of als concentratieafhankelijkheden) en de duur van de blootstelling. Houd rekening met de oplosbaarheid en vul voorraden aan in het gewenste oplosmiddel zoals water, DMSO of ethanol. Selecteer de timing van injecties en volgende injecties, zodat de respons een stabiele toestand bereikt voordat een volgend middel wordt toegevoegd. Pas bij het herhalen van protocollen de timing van injecties aan, zodat het gemiddelde van meerdere tijdskuren kan worden genomen.OPMERKING: De hier gebruikte verbindingen zijn afkomstig van een eerdere mitochondriale (Mito) stresstest 11 en zowel oligomycine als carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy)fenylhydrazon (FCCP) vereisen DMSO, zowel in de voorraadoplossingen als in het uiteindelijke perifusaat. Uitstroombemonsteringstijden: Selecteer de gewenste fractie-verzamelintervallen (van 1-60 min/monster), waarbij snellere bemonsteringsfrequenties worden gekozen voor snelle veranderingen en langere tijdsintervallen worden gekozen naarmate de stationaire toestand wordt benaderd. Gebruik voldoende putvolumes (0,3 tot 1,5 ml) om overlopen tijdens het bemonsteringsinterval te voorkomen (kies volumes die groter zijn dan het debiet x het tijdsinterval).OPMERKING: De bemonsteringstijden zijn afhankelijk van de keuze van het protocol, maar voor een Mito-stresstest hebben we gewoonlijk intervallen van 5 minuten gebruikt tijdens de basislijn en intervallen van 15 minuten tijdens de injecties (-15, -10, -5, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, waarbij elke keer het begin van het bemonsteringsinterval is). Voer de hierboven beschreven geselecteerde waarden voor testverbindingen en fractieverzameling in de gebruikersinterface (UI) in, die grafische weergaven van deze informatie genereert. Exporteer en verspreid bestanden voor groepsevaluatie en discussies (aanvullende figuur 1). Leg de accessoires en verbruiksonderdelen klaarVermeld de benodigdheden die door de fabrikant zijn geleverd en aseptisch zijn voorverpakt, waaronder: TCA’s (pakket van 8), uitstroomslangen (pakket van 8 buizen), injectieslangen van testverbindingen (2), pincetten, slangklemmen (3), MRM, MRM-inzetstukken (2), roerstaven (2) en spoelslangen (geplaatst in een biologische veiligheidskast). Gebruik wegwerponderdelen die in contact komen met vloeistof niet opnieuw, omdat dit zal leiden tot een toename van het falen van experimenten. Hergebruik de pincet en roerstaven door ze tussen de experimenten door schoon te maken en in de autoclaaf te zetten. 2. Bereiding en balancering van perifusaat (Tijd: 30 min exclusief incubatietijd) Bereid het medium of de Krebs-Ringer-bicarbonaatbuffer (KRB) de dag ervoor voor op basis van berekeningen uit vergelijking 1, meestal 200 ml, en incubeer vervolgens een nacht in een incubator van 39 °C/5% CO2 in T225-weefselkweekkolven met niet meer dan 90 ml in elke kolf. Bij gebruik van commercieel bereide KRB of media (opgewarmd tot kamertemperatuur), bereid het perifusaat op de ochtend van het experiment en plaats het gedurende ten minste 1 uur in de 5% CO2 -incubator. Bereid alle oplossingen aseptisch voor.OPMERKING: Alle vloeistoffen en onderdelen van het fluidics-systeem die in contact komen met vloeistof zijn aan het begin van het experiment steriel. De assemblage van het systeem en het laden van het weefsel wordt echter open naar de lucht uitgevoerd. 3. Evenwicht van temperatuur en opgelost gas om het instrument in te stellen (Tijd: 75 min) Bevestiging van slangassemblages aan de MRMPlaats de MRM en een fluidics-pakket op de bank naast het instrument. Zorg ervoor dat de slangklemmen (3), roerstaven (2) en pincetten al op de gereedschapsbak zitten. Plaats een ongebruikt MRM-inzetstuk met een roerstaaf aan elke kant van de MRM (zie afbeelding 3). Bevestig de TCA’s aan injectiepoorten aan beide uiteinden van de MRM, zodat het uiteinde van de slang direct boven de roerstaaf wordt geplaatst. Zorg ervoor dat de langste van de twee injecties van het testmiddel zich op de achterkant van de MRM bevindt. Bevestig vervolgens de gastoevoerleiding en de ontluchtingsslang aan respectievelijk de achterste en voorste lege poorten (zie afbeelding 4A). Plaatsen van de MRM/slangassemblages in de behuizingPlaats de MRM (met de slangen bevestigd) in de MRM-verwarmer (Figuur 4B). Plaats de vier slangassemblages in de groeven van de wanden in de bodem van de behuizing (twee aan elke kant) zodat ze naar de buitenkant van de behuizing uitsteken zodra de middelste behuizing op zijn plaats is geplaatst. Zet de MRM tussen de klemmen vast door de twee wielen op de detectorstandaard vast te draaien. Voer de langere injectieeenheid van het testmiddel die uit de achterkant van de behuizing steekt door de twee buisgeleiders aan de zijkant van de behuizing, zodat de opening van de buizen naar voren wijst (Figuur 4C). Klem elk van de gesloten injectiesamenstellingen van de teststof vast. Montage van de behuizing en activering van de temperatuurregelaarsZet de stekkerdoos die alle elektrische apparaten in de behuizing van stroom voorziet in de AAN-stand. De ventilator op de detectorstandaard gaat AAN en de MRM-temperatuurregelaar moet oplichten met een ingestelde waarde van 38 °C (Figuur 5). Zet de roerders AAN tot 70 tpm met behulp van de gebruikersinterface om ervoor te zorgen dat de roerstaven soepel draaien. Zodra goed roeren in acht is genomen, schakelt u de roerders uit. Plaats het middelste gedeelte van de behuizing bovenop de basis. Sluit de kabel op het middelste gedeelte van de behuizing aan op de kabel van de elektriciteitskast om de hendelschakelaar van de omgevingstemperatuurregelaar van stroom te voorzien en de omgevingstemperatuurverwarming van stroom te voorzien. Plaats het deksel op de behuizing en het display van de bovenste temperatuurregelaar (de omgevingstemperatuurregelaar) licht op en geeft 36 °C aan. Start een timer gedurende 30 minuten, de tijd die de MRM-verwarmer nodig heeft om de ingestelde temperatuur te bereiken. De TCA’s in het PCM invoegenGebruik het TCA-inbrenggereedschap om elk van de 8 TCA’s in de PCM-gaten te steken door stevig op de adapter te drukken met de voorkant van het inbrenggereedschap totdat de bovenkant van de slanghuls die om de weefselkamer is gewikkeld, het oppervlak raakt dat de gaten in de PCM omschrijft. Plaats een TCA volledig voordat u de volgende plaatst. Leg de gedeeltelijk gemonteerde PCM opzij naast de PCM-beugel en 6 schroeven.NOTITIE: Onvolledige insertie van een TCA voorkomt dat de hoofdruimte het drukinstelpunt bereikt en perifusaat zal niet stromen. Vullen van de twee inserts in de MRM met vooraf geëquilibreerd perifusaatOm dit te doen, brengt u 30 minuten nadat de behuizing is gemonteerd en de MRM de temperatuur heeft bereikt, het vooraf uitgebalanceerde perifusaat over in het voorverwarmde MRM-inzetstuk door de vloeistof voorzichtig langs de zijkanten te doseren met behulp van een pipet van 50 ml.OPMERKING: Deze stappen, evenals die in punt 3.6, moeten onmiddellijk worden uitgevoerd om overdracht van gas tussen het perifusaat in de MRM en de atmosfeer te voorkomen. Montage van de MRM/PCM om een gasdichte afdichting te creëren en positionering van de O2 detectorPlaats de PCM op de MRM door de weerstandsbuizen van de TCA’s die uit de onderkant van de PCM komen in de MRM-inzetstukken te steken, 4 aan elke kant van de MRM-verdeler. Richt de PCM zo dat de weefselkamers tegen deO2-detector kunnen rusten zodra deze is gepositioneerd. Zet de PCM en de PCM-steunbeugel vast met de 6 schroeven met behulp van de elektrische schroevendraaier. Zet de TCA’s vast in de PCM-steunvinnen met de meegeleverde elastische band door deze rond de vinnen van de PCM te spannen ter hoogte van de rubberen pakkingen (Figuur 6). Plaats de O2-detector op de detectorstandaard zodat de voorkant ervan tegen de vinnen van de PCM rust. Controleer of de LED-/fotodetectorparen op één lijn liggen met deO2-gevoelige kleurstof in de weefselkamers. Stel indien nodig de zijgeleiders van de O 2-detector af nadat u de stelschroeven aan de zijkant van de O2-detectorhouder hebt losgedraaid. Plaats het deksel op de behuizing. Het in evenwicht brengen van het gas in de hoofdruimte in de MRM met het perifusaatMet de hogedrukklep volledig vastgezet en gesloten, opent u de klep van de gastank door de cilinderklep bovenop de tank tegen de klok in te draaien. Stel de hogedrukregelaar in op een druk van 10 psi met behulp van de knop op de regelaar. Zet de MRM onder druk door de lagedrukregelaar in te stellen op 1.0 psi (Figuur 7A). Maak de ontluchtingsbuis (Figuur 7B) los zodat het gas uit de tank de lucht in de MRM-vrije ruimte kan vervangen (de injectoren van de teststof blijven vastgeklemd) gedurende 15 minuten. Bevestig de gasstroom door het uiteinde van de spoelbuis onder te dompelen in een beker water om het borrelen te observeren. Zodra het debiet is bevestigd, start u de O2-detector zoals hieronder beschreven in paragraaf 3.8. Zet de roerder na 15 minuten aan op 70 toeren per minuut en laat de rest van het experiment draaien. Klem na nog eens 15 minuten de spoelslang vast (Figuur 7C). Verlaag de druk op de lagedrukregelaar tot de werkdruk die het gewenste vloeistofdebiet bereikt (zoals gespecificeerd door het experimentele pakket – meestal tussen ongeveer 0.5-0.7 psi). Als het debiet hoger is dan 20 μL/min, stel dan tijdelijk de druk in op 0.3 psi om tijd te geven om het weefsel te laden zonder dat de kamers overlopen. Dit is niet nodig als het weefsel binnen 15 minuten na het plaatsen van de klem wordt belast.NOTITIE: Laat de buffer niet langs de buitenkant van de weefselkamer lopen, aangezien de vloeistof deO2-detectie kan verstoren. Starten van de O2 detectorActiveer de O2-detectorsoftware op de laptop door op het pictogram met het label Zuurstofdetector te klikken. Zodra het programma is geopend (aanvullende afbeelding 2), controleert u of de juiste COM-poort is geselecteerd. Indien nodig kan de COM-poort worden geïdentificeerd door de O2-detector los te koppelen en aan te sluiten op de computer, zodat het poortnummer wordt weergegeven. Als de COM-poort wordt losgekoppeld terwijl de toepassing actief is, moet de toepassing voor gebruik worden gesloten en opnieuw worden geopend. Klik op Start en vervolgens op Opnemen (en sla de gegevens op in de back-upmap). Klik vervolgens op Grafiek. Verander de gemiddelde waarde linksonder in de levensduurgrafiek naar 5 (die het programma instrueert om een voortschrijdend gemiddelde te berekenen met 5 opeenvolgende punten). Nadat er een minuut is verstreken en het eerste gegevenspunt wordt weergegeven op het grafiekscherm, klikt u op Automatisch schalen. 4. Weefsellaad- en evenwichtsperiode (Tijd: 90 min) Positionering van de fritten in de weefselkamersVerwijder het deksel en het middelste gedeelte van de behuizing. Nadat het perifusaat in de weefselkamers boven de bovenkant van de vooraf geplaatste fritte is gestegen, duwt u de fritte naar beneden met de fritte-cue door lichtjes op de bovenkant van de fritte te tikken om eventuele luchtbellen te verwijderen die zich onder of in de fritte hebben gevormd. Plaats fritten ongeveer 0.25 inch boven de bodem van de weefselkamer. Weefsel in de weefselkamers ladenZodra het medianiveau 0.5 inch van de bovenkant is, laadt u het weefsel in de kamer. Retina of RPE-choroide-sclera laden: Oogst Retina of RPE-choroide-sclera zoals beschreven in 6. Om het weefsel te laden, gebruikt u een pincet met een fijne punt om het weefsel voorzichtig in elke kamer te plaatsen, waarbij u ervoor zorgt dat u het weefsel niet vouwt, terwijl u een doekje gebruikt om te voorkomen dat vloeistof uit de weefselkamer op de O2-sensor druppelt. Observeer weefsel dat naar en op de frit zakt.OPMERKING: Tussen het moment van het oogsten van het weefsel en het laden van weefsel in de kamers, moet u ervoor zorgen dat trauma aan het weefsel wordt vermeden door het weefsel niet langer dan 10 minuten in een op bicarbonaat gebaseerde buffer/media uit de incubator te laten en ervoor te zorgen dat het weefsel baadt in voldoende buffer/media (ten minste 1 ml/10 mg weefsel) om te voorkomen dat het weefsel hypoxisch wordt en blootstelling aan lucht wordt voorkomen. Laden van RPE-cellen op transwellmembranen: Bereid RPE-cellen voor zoals eerder beschreven 12 en in aanvullend bestand 1. Doorgangscellen met 0,25% trypsine-EDTA en zaad op polyethyleentereftalaat, spoorgeëtste filters (celkweekinzetstukken, poriegrootte 0,4 mm) met een minimum van 2,0 x 105 cellen/cm2. Snijd op de dag van het experiment de vliezen in drie stroken van gelijke breedte en laad ze met een pincet in de weefselkamers (zie figuur 8A). Bevestiging van de uitstroomslangassemblages aan weefselkamersHaal de uitstroomslangassemblages uit de verpakking en plaats de uitstroomslangafscheider op de lip van het middelste gedeelte van de behuizing, zodat de uitstroomslangadapters zich aan de binnenkant van de behuizing bevinden (Figuur 8B,C). Zorg ervoor dat u niet te hard op de TCA’s drukt (anders komen ze los van de MRM), en bevestig de uitstroomslangadapters aan de bovenkant van de TCA’s van de weefselkamers (Figuur 8D). Plaats het midden van de behuizing terug en sluit de kabel voor de omgevingstemperatuurregeling weer aan. Voordat u het deksel van de behuizing terugplaatst, moet u controleren of de componenten van het fluidics-systeem in de behuizing, inclusief de O2-detector , PCM, weefselkamers, uitstroombuizen, MRM en verwarming, allemaal correct zijn geplaatst, zoals weergegeven in afbeelding 8E. Plaats het deksel van de behuizing terug. Voer de acht uitstroombuizen door de geleidingsarm van de fractiecollector. Activeren van de breukverzamelaarZorg ervoor dat de fractiecollector gecentreerd is ten opzichte van de rechterwand van de behuizing en de uitstroombuishouder: de linkersteun van de basis van de fractiecollector moet tegen de rand van de behuizingswand rusten. Klik op de laptop op de UI-snelkoppeling en de experimentele infopagina wordt geopend (aanvullende afbeelding 3 bovenaan). Vul de informatie in de daarvoor bestemde vakken op de experimentele infopagina in (dit kan worden gedaan voordat het experiment begint) en klik vervolgens op de pagina Flow & Fracture Collector bovenaan (aanvullende figuur 3 onderaan). Parameters instellen voor geautomatiseerde debietmetingSelecteer de gewenste integratietijd in het vervolgkeuzemenu Sample-acquisitietijd in het midden bovenaan, waarbij de gewenste nauwkeurigheid (die evenredig is met de integratietijd) en de temporele resolutie in evenwicht worden gebracht. Als er geen uitstroomfracties worden verzameld in het experiment, klikt u op Start en gaat u naar sectie 4.7. Als er uitstroomfracties worden verzameld, voer dan de stappen uit in paragraaf 4.6. Opvangen van uitstroomfractiesVink in de UI-software de optie Breuken verzamelen? op de pagina met experimentinformatie of op de pagina Flow & Fracture Collector. Klik vervolgens op de knop Compute FC-instellingen . Wanneer het nieuwe venster wordt geopend, vult u het tijdstip van de eerste injectie in het protocol in (gedefinieerd als tijd = 0) en het debiet per kanaal, evenals de tijdsintervallen voor elk monster. Klik vervolgens op Berekenen. Zodra de intervallen van de verzameling zijn geverifieerd, klikt u op Genereren en starten. Meten van debieten voor afzonderlijke kanalen (optioneel)Als de stroomsnelheden van afzonderlijke kanalen moeten worden gemeten (die onder normale omstandigheden slechts enkele procenten afwijken), weeg dan acht (of minder) microcentrifugebuisjes en noteer hun gewicht. Plaats de buishouder met de voorgewogen microcentrifugebuisjes op de platenwagen. Klik op Debiet handmatig meten in het gedeelte met andere hulpprogramma’s. Selecteer de duur van de meting en klik vervolgens op Sjabloon genereren. Sluit het venster en klik op Start. De fractiecollector verzamelt vloeistof uit de uitstroombuizen voor de meetduur en daarna keert de arm terug naar zijn uitgangspositie. Weeg de microfuge-buisjes na het verzamelen en gebruik het verschil in gewicht gedeeld door de meetduur om het debiet te berekenen (waarbij 1 mg = 1 μL). Stabilisatie van de basislijnZodra het weefsel en/of de cellen in de weefselkamers zijn geladen, laat u het systeem gedurende 90 minuten in evenwicht komen om een vlakke basislijn vanO2-verbruik vast te stellen, waarna de eerste teststof kan worden geïnjecteerd (beschouwd als tijd = 0). Voer 30 minuten voor de eerste injectie de gemiddelde waarde van de laatste 3 FR per kanaal in op de injectiepagina voor het voorbereiden van injecties met testverbindingen. 5. Experimenteel protocol (Tijd: 2-6 uur) OPMERKING: Zodra de basislijnstabilisatie aan de gang is, zijn de volgende taken het injecteren van de testverbindingen en het verwisselen van platen op de fractiecollector als er meer dan één wordt gebruikt. Bereiding van teststof injecterenVoer de namen van de verbindingen, de gewenste concentraties (eind- en voorraadoplossingen) en de injectietijden van de testverbindingen in de tabel in de gebruikersinterface op de injectiepagina in. Bevestig de informatie die in het programma wordt weergegeven, inclusief de volumes in de MRM die nog over zijn op het moment van de injecties en hoeveel stockoplossing moet worden geïnjecteerd om de gewenste concentraties te bereiken (aanvullende figuur 4). Om te berekenen hoeveel perifusaat en voorraad nodig zijn voor de injectie, vult u de witte vakjes van de injectietabel in en klikt u op Berekenen. Verdun de oplossing van de teststof vóór de injectie met perifusaat, zodat het geïnjecteerde volume na injectie 5% van het volume in de MRM bedraagt. Bereid elke teststof voor door de stockoplossing en het perifusaat te mengen. Vul de spuiten ten minste 10 minuten voor de injectietijd en bewaar ze in een CO2 -incubator (op temperatuur tussen 37-40 °C) tot ze klaar zijn om te injecteren. Injecteren van teststoffenSluit de spuit met het testmiddel aan op de injectieleidingen (Figuur 9A). Maak de zachtwandige slangen die naar de injectieleiding leiden los en injecteer langzaam testverbindingen (Figuur 9B) met een snelheid van ongeveer 3 ml/min. Klem de slang weer vast op de injectieleiding en verwijder vervolgens de spuit (Figuur 9C); herhaal dit voor de andere kant van de MRM. Bereid na het injecteren van elk testmiddel elk volgend testmiddel voor dat moet worden geïnjecteerd volgens de UI-injectiepagina. Bepalen van het instroom O2-signaal voor elk kanaalInjecteer aan het einde van elk experiment de respiratoire remmer KCN (3 mM) om het instroomsignaal voor elk kanaal te bepalen dat wordt gebruikt om te corrigeren voor de variatie in de levensduur van de basissensor en het niet-mitochondriale zuurstofverbruik. 6. Beëindigen van het experiment en afbreken van het systeem (Tijd: 30 min) Zuurstofgegevens opslaanKlik op de knop Opslaan in de linkerbovenhoek van het grafische venster van de zuurstofdetectorsoftware; Geef het bestand een naam en sla het op in de map waar het bestand wordt bewaard. Klik op de Stop opname knop in het hoofdvenster om het back-upbestand op te slaan. Het experimentele infobestand van de gebruikersinterface opslaanKlik op de knop Profiel opslaan in de linkerbovenhoek van de algemene pagina van de gebruikersinterface; Geef het bestand een naam en sla het op in de map waar het bestand wordt bewaard. Klik op de pagina Breuk en stroom van de gebruikersinterface op het vervolgkeuzemenu Extra en vervolgens op Opslaan. Behoud de gegenereerde naam of kies een andere en sla het bestand op waar gewenst. Indien nodig zijn er back-upbestanden die kunnen worden geopend en opgeslagen. Het instrument afbrekenAangezien KCN vluchtig is, moet u fluidics-assemblages in een zuurkast weggooien; giet media uit de MRM- en FC-afvalbak in een afvalcontainer en spoel de MRM-inzetstukken en roerstaven grondig af met water. Giet de inhoud van de afvalcontainer (met KCN) in een gelabelde container voor chemisch afval voor verdere verwijdering door chemische veiligheid. Reinig en autoclaaf de roerstaven en pincetten voorafgaand aan het volgende experiment grondig. 7. Gegevensverwerking (Tijd: 15-45 min) Open de gegevensverwerkertoepassing op een Mac- of pc-computer. Selecteer het .csv gegevensbestand dat door een experiment is gegenereerd. Als het protocol van dit experiment vergelijkbaar is met een eerder geanalyseerd experiment, selecteert u dat instellingenbestand en klikt u op Volgende stap. Klik anders op Volgende stap om de instellingen van het experiment in te voeren. Vul de verschillende instellingen van het experiment in. Selecteer bij het bepalen van het referentietijdstip het tijdstip direct voordat de KCN van kracht werd en de levensduurwaarden daalden. Selecteer dit punt met behulp van een schuifregelaar of door de tijdwaarde in het vak te typen. Klik op Berekenen om OCR-grafieken te genereren volgens vergelijking 2:OCR = ([O 2]in- [O 2]uit) x FR = (217 nmol/ml – [O 2]uit) x FR/weefselbasis (Eq. 2)waarbij de O 2-concentratie in KRB in evenwicht met 21% O2 bij 37 °C 217 nmol/ml is, FR de stroomsnelheid is (in ml/min), weefselbasis de hoeveelheid weefsel die in de kamer is geladen (d.w.z. aantal netvliezen, RPE-choroïde-sclera of RPE-cellen). Sla de grafieken op als .pdf bestanden door op de knop Grafiek exporteren te drukken. Maak een grafiek van OCR als absolute waarden of als een fractie van een steady-state-waarde door de vakjes aan te vinken die overeenkomen met de teststof die op 1 moet worden gezet op de pagina met bewerkingsinstellingen. 8. Analyse van uitstroomfracties Als de monsters niet onmiddellijk na het experiment kunnen worden getest, worden de platen bij 4 °C geplaatst als ze de volgende dag worden getest, of ingevroren als ze langer worden bewaard. Als de platen bevroren zijn, ontdooi de monsters dan bij 4 °C (zodat de monsters koud blijven). Zodra tests zijn uitgevoerd op de geselecteerde uitstroomfracties, worden de kolommen met gegevens (één per kanaal) ingevoerd in een .csv bestand met tijd (in min) in de meest linkse kolom en concentratie in de rechter (in nmol/ml of ng/ml); Een link in het gegevensverwerkingsprogramma uploadt een sjabloon. Upload dit bestand naar de gegevensverwerker om de gegevens te berekenen en te plotten.