新しいポンプレス流路システムを使用した眼のさまざまな組織および細胞タイプの維持と評価

ラットおよびマウスから組織を採取するためのすべての手順は、ワシントン大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。 1. 実験前の準備 注:以下のタスクは、実験の少なくとも1日前に完了してください。 実験プロトコルの設計 チャンネルでの組織配置の割り当て:MRMの両側にある4つのチャンネルのうち3つに配置する組織または細胞モデルを選択します。両側に1つの組織チャンバーは、ベースライン補正に使用する組織なしで実行されます。 2つの典型的なデザイン(両側で異なる試験化合物プロトコル)のいずれかを使用してサンプルを配置します(たとえば、MRMの片側のチャネルはテスト化合物を受け取り、反対側のチャネルはコントロールとして機能します)。MRMの両側で同じ試験化合物注入プロトコルを使用しますが、MRMの両側で異なる組織または組織モデルと対照を比較します。 最適なOCR測定のための流量と組織量の選択:ライフタイム比の変化に100倍が約3になるまで流量を調整します。注:組織および対応する流動度の典型的な量は器械が6-80 μL/min/channel間の流動度で最もよく作用する目の部品のための 表1 に示されている。 必要な培地/バッファー容量の計算:実験開始時に各 MRM インサートに追加する培地の容量を次のように計算します。容量 MRM = 30 mL + プロトコル持続時間(分) x 流速(mL/分) x 4 チャンネル(式 1)例えば、0.01 mL/分では、60 mLの開始容量MRM では 12.5 時間のプロトコル(30 mL は枯渇し、30 mL は残存)が可能ですが、0.04 mL/分では、90 mL の開始容量MRM では 6 時間のプロトコル(残り 30 mL)が可能です。 試験化合物注入プロトコル:評価する試験化合物、試験する濃度(通常、最大に近い反応が得られるように、または濃度依存性として選択)、および曝露期間を選択します。溶解性を考慮し、水、DMSO、エタノールなどの目的の溶媒でストックを構成します。 注入とその後の注入のタイミングを選択して、後続の薬剤を追加する前に応答が定常状態に達するようにします。プロトコルを繰り返す場合は、複数の時間経過を平均化できるように、注入のタイミングを一致させます。注:ここで使用した化合物は、以前のミトコンドリア(Mito)ストレステスト 11 からのものであり、オリゴマイシンとカルボニルシアン化物4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)の両方が、原液と最終的なペリフューセートの両方にDMSOを必要とします。 流出サンプリング時間:急激な変化にはより速いサンプリングレートが選択され、定常状態に近づくにつれてより長い時間間隔が選択される、目的のフラクション収集間隔(1〜60分/サンプル)を選択します。サンプリング間隔中のオーバーフローを避けるために、適切なウェル容量(0.3〜1.5 mL)を使用します(流量x時間間隔よりも大きい容量を選択してください)。注:サンプリング時間はプロトコルの選択によって異なりますが、Mitoストレステストでは、ベースライン中に5分間隔、注入中に15分間隔(-15、-10、-5、0、15、30、45、60、75、90、105、各時間がサンプリング間隔の開始)を使用するのが一般的です。 上記の試験化合物とフラクション回収用に選択した値をユーザーインターフェース(UI)に入力すると、この情報がグラフィカルに表示されます。グループ評価とディスカッションのためにファイルをエクスポートして配布します(補足図1)。 付属品と消耗部品をセットしますTCA(8本入り)、流出チューブアセンブリ(8本入り)、試験化合物注入チューブ(2本)、鉗子、チューブクランプ(3)、MRM、MRMインサート(2)、攪拌子(2)、パージチューブアセンブリ(生物学的安全キャビネットに収納)など、メーカーが提供し、無菌的に梱包した消耗品を記載します。 液体と接触する使い捨て部品は、実験の失敗の増加につながるため、再利用しないでください。鉗子と攪拌子は、実験の合間に洗浄およびオートクレーブ滅菌して再利用します。 2. 混読液の調製と平衡化(時間:30分、インキュベーション時間を含まない) 式 1 の計算に基づいて培地または Krebs-Ringer 重炭酸緩衝液 (KRB) (通常は 200 mL) を調製し、各フラスコに 90 mL 以下の T225 組織培養フラスコの 39 °C/5% CO2 イン キュベーターで一晩インキュベートします。 市販のKRBまたは培地(室温に加温)を使用する場合は、実験の朝にペリフューセートを調製し、5%CO2 インキュベーターに少なくとも1時間入れます。すべての溶液を無菌的に調製します。注:液体と接触するすべての液体および流路系の部品は、実験の開始時には無菌状態です。但し、システムの組み立て及び組織の装填は、空気に開放して行われる。 3.温度と溶存ガスの平衡化による装置設置(時間:75分) MRMへのチューブアセンブリの取り付けMRMと流路系パッケージを装置の隣のベンチに置きます。チューブクランプ(3)、攪拌子(2)、および鉗子がすでにツールトレイ上にあることを確認します。 MRM の両側に攪拌子付きの未使用の MRM インサートを取り付けます ( 図 3 を参照)。 TCA を MRM の両端の注入ポートに取り付けて、チューブの端が攪拌子の真上になるようにします。2 つの試験化合物注入アセンブリーのうち、長い方の方を MRM の背面に取り付けます。 次に、ガス流入供給ラインとパージチューブアセンブリをそれぞれ背面と前面の空いているポートに取り付けます( 図4Aを参照)。 MRM/チューブ・アセンブリーのエンクロージャーへの配置MRM(チューブアセンブリを取り付けた状態)をMRMヒーターに入れます(図4B)。 4 つのチューブ アセンブリをエンクロージャの底部の壁の溝 (両側に 2 つずつ) に配置して、中央のエンクロージャを所定の位置に配置したときにエンクロージャの外側に突き出るようにします。 検出器スタンドの2つの車輪を締めて、クランプの間にMRMを固定します。 エンクロージャーの背面から突き出た長い方の試験化合物注入アセンブリーを、チューブの開口部が前方を向くように、エンクロージャーの側面にある 2 つのチューブガイドに通します(図 4C)。 閉じた各試験化合物注入アセンブリをクランプします。 エンクロージャーの組み立てと温度コントローラーのアクティブ化エンクロージャー内のすべての電気機器に電力を供給する電源タップをオンの位置に切り替えます。検出器スタンドのファンがオンになり、MRM温度コントローラが点灯し、設定値38°Cが表示されます(図5)。 UIを使用して攪拌機を70rpmまでオンにし、攪拌子がスムーズに回転していることを確認します。適切な攪拌が観察されたら、攪拌機の電源を切ります。 エンクロージャーの中央部分をベースの上に置きます。 エンクロージャーの中央部分のケーブルを電気ボックスからのケーブルに接続して、周囲温度コントローラーのレバースイッチに電力を供給し、周囲温度ヒーターに電力を供給します。 エンクロージャーに蓋をすると、上部温度コントローラー(周囲温度コントローラー)のディスプレイが点灯し、36°Cを読み取ります。 MRMヒーターが設定温度に達するのにかかる時間である30分間タイマーを開始します。 PCM への TCA の挿入TCA挿入ツールを使用して、組織チャンバーに巻き付けられたチューブスリーブの上部がPCMの穴を囲む表面に触れるまで、挿入ツールの表面でアダプターをしっかりと押して、8つのTCAのそれぞれをPCM穴に挿入します。 次の TCA を挿入する前に、1 つの TCA を完全に挿入します。部分的に組み立てられた PCM を PCM ブレースと 6 本のネジの横に置いておきます。注意: TCAの挿入が不完全な場合、ヘッドスペースが圧力設定値に到達できず、ペリフューセートが流れなくなります。 MRM の 2 つのインサートに平衡化済みの近溶化物を充填これを行うには、エンクロージャーが組み立てられ、MRMが温度に達してから30分後に、50 mLピペットを使用して液体を側面に静かに分注することにより、事前に平衡化されたペリフューセートを予熱したMRMインサートに移します。注:これらの手順は、セクション3.6の手順と同様に、MRM内の拡散物と大気中のガスの移動を避けるために、すぐに実行する必要があります。 MRM/PCMを組み立てて気密シールを作成し、O2 検出器を配置PCM の底部から出ている TCA の抵抗チューブを MRM インサート(MRM ディバイダの両側に 4 本ずつ)に挿入して、PCM を MRM に配置します。PCMの位置が決まったら、組織チャンバーがO2 検出器に対して休むことができるようにPCMの向きを合わせます。 電動ドライバーを使用して、PCMとPCMサポートブレースを6本のネジで固定します。 ゴム製ガスケットの高さでPCMのフィンの周りに伸ばして用意されたゴムバンドを使用して、PCMサポートフィン内のTCAを固定します(図6)。 O2検出器を検出器スタンドに配置して、その面がPCMのフィンに当たるようにします。LED/光検出器のペアが、組織チャンバー内のO2感受性色素と整列していることを確認します。必要に応じて、O2検出器ホルダーの側面にある止めネジを緩めた後、O2検出器のラテラルガイドを調整します。 エンクロージャーの上に蓋を置きます。 MRMのヘッドスペース内のガスをペリフューセートで平衡化させる高圧バルブを完全に固定して閉じた状態で、タンク上部のシリンダーバルブを反時計回りに回してガスタンクバルブを開きます。 レギュレーターのノブを使用して、高圧レギュレーターを10psiの圧力に調整します。 低圧レギュレーターを 1.0 psi に設定して MRM を加圧します(図 7A)。 パージチューブ(図7B)のクランプを外して、タンクからのガスがMRMヘッドスペース内の空気と入れ替わるようにします(試験化合物インジェクターはクランプされたまま)。パージチューブの端を水の入ったビーカーに沈めてガスの流れを確認し、泡立ちを観察します。 流れが確認されたら、以下のセクション2で説明するようにO3.8 検出器を起動します。 15分後、攪拌機を70rpmでオンにし、実験の残りは運転したままにします。さらに15分後、パージチューブアセンブリをクランプします(図7C)。 低圧レギュレーターの圧力を、目的の液体流量(実験パックで指定されているように、通常は約0.5〜0.7psi)を達成する動作圧力まで下げます。流量が20 μL/分を超える場合は、一時的に圧力を0.3 psiに設定して、チャンバーがオーバーフローすることなく組織に負荷をかける時間を確保します。これは、クランプが置かれてから15分以内に組織が装填されている場合は必要ありません。注:液体がO2 センシングに干渉する可能性があるため、緩衝液を組織チャンバーの外側に流さないでください。 O2検出器の始動酸素検出器というラベルの付いたアイコンをクリックして、ラップトップでO2検出器ソフトウェアをアクティブにします。 プログラムが開いたら(補足図2)、正しいCOMポートが選択されていることを確認します。必要に応じて、ポート番号が表示されるように、O2 検出器をコンピューターから抜き差しすることにより、COMポートを識別できます。アプリケーションの実行中にCOMポートが取り外された場合は、使用する前にアプリケーションを閉じてから再度開く必要があります。 [ スタート ]、[ 記録 ]の順にクリックします(バックアップフォルダにデータを保存します)。次に、「 グラフ」をクリックします。 ライフタイム グラフの左下にある平均値を 5 に変更します (これにより、5 つの連続するポイントで移動平均を計算するようにプログラムに指示されます)。1分が経過し、最初のデータポイントがグラフ画面に表示されたら、[ 自動スケール]をクリックします。 4.ティッシュのローディングおよび平衡化期間(時間:90分) 組織チャンバー内のフリットの位置決めエンクロージャーの蓋と中央部分を取り外します。 組織チャンバー内のペリフューセートがあらかじめ配置されたフリットの上部より上に上がった後、フリットの上部を軽くたたいてフリットキューでフリットを押し下げ、フリットの下または内部に形成された気泡を取り除きます。 位置フリットは、組織チャンバーの底から約0.25インチ上にあります。 組織チャンバーへの組織の装填培地のレベルが上から0.5インチになったら、ティッシュをチャンバーに入れます。 網膜またはRPE-脈絡膜強膜のロード: 6で説明されているように、網膜またはRPE-脈絡膜強膜を採取します。組織を装填するには、組織を折りたたまないように注意しながら、細点鉗子を使用して組織を各チャンバーにそっと配置し、組織チャンバーからの液体がO2 センサーに滴り落ちるのを防ぐためにティッシュワイプを使用します。組織がフリットに向かって沈むのを観察します。注:組織を採取してからチャンバーに組織を装填するまでの間は、組織を重炭酸塩ベースの緩衝液/培地に10分以上放置せず、組織が低酸素状態になるのを防ぎ、空気への曝露を防ぐために、組織を十分な緩衝液/培地(少なくとも1 mL / 10 mgの組織)に浸すことにより、組織への外傷が回避されるようにします。 トランズウェル膜へのRPE細胞のロード:前述 した12 および 補足ファイル1で説明したように、RPE細胞を調製します。0.25%トリプシン-EDTAを使用し、ポリエチレンテレフタレート上のシード、トラックエッチングフィルター(細胞培養インサート、ポアサイズ0.4 mm)を最小2.0 x 105 cells/cm2で継代細胞。実験当日に、メンブレンを同じ幅の3つのストリップに切断し、鉗子で組織チャンバーにロードします( 図8Aを参照)。 組織チャンバーへの流出チューブアセンブリの取り付け流出チューブアセンブリをパッケージから取り出し、流出チューブアダプターがエンクロージャーの内側に来るように、流出チューブセパレーターをエンクロージャーの中央セクションのリップに配置します(図8B、C)。 TCAを強く押しすぎないように注意しながら(そうしないとMRMから緩んでしまいます)、排出チューブアダプターを組織チャンバーTCAの上部に取り付けます(図8D)。エンクロージャーの中央を元に戻し、周囲温度制御ケーブルを再接続します。 エンクロージャーの蓋を交換する前に、図 8E に示すように、O2 検出器、PCM、組織チャンバー、排出チューブ、MRM、ヒーターなど、エンクロージャー内の流路系のコンポーネントがすべて適切に配置されていることを確認します。 エンクロージャーの蓋を取り付けます。8本の排出チューブをフラクションコレクターガイドアームに通します。 フラクションコレクターのアクティブ化フラクションコレクターがエンクロージャーの右側の壁と流出チューブホルダーに対して中央にあることを確認してください:フラクションコレクターベースの左側のサポートは、エンクロージャーの壁の端に寄りかかっている必要があります。 ラップトップで UI ショートカットをクリックすると、実験情報ページが開きます (補足図 3 上)。 実験情報ページの適切なボックスに情報を入力し(これは実験開始前に行うことができます)、上部の Flow & Fraction Collector ページをクリックします(補足図3 、下)。 自動流量測定のパラメータ設定中央上部のサンプル取得時間ドロップダウンメニューで、目的の精度(積分時間に比例)と時間分解能のバランスが取れた積分時間を選択します。 実験で流出率が収集されない場合は、[開始]をクリックしてセクション4.7に進みます。流出率を収集する場合は、セクション4.6の手順を実行します。 流出率の収集UIソフトウェアで、 Collect fractions? ボックスを [実験情報] ページまたは [Flow & Fraction Collector] ページのいずれかに表示します。次に、[ Compute FC Settings ] ボタンをクリックします。 新しいウィンドウが開いたら、プロトコルの最初の注入時間(時間 = 0 として定義)、チャンネルごとの流量、および各サンプルの時間間隔を入力します。次に、「 計算」をクリックします。 コレクションの間隔が確認されたら、[ Generate and Start] をクリックします。 各チャンネルの流量測定(オプション)個々のチャネルの流量を測定する場合(通常の条件下では数パーセントしか変化しません)、8本(またはそれ以下)の微量遠心チューブの重量を量り、その重量を記録します。 計量済みの微量遠心チューブが入ったチューブホルダーをプレートキャリッジにセットします。その他のユーティリティセクションの 流量を手動で測定(Measure Flow Rate Manually )をクリックします。 測定期間を選択し、「 テンプレートの生成」をクリックします。ウィンドウを閉じ、[ 開始]をクリックします。フラクションコレクターは、測定期間中、流出チューブから液体を収集し、その後、アームはホームポジションに戻ります。 回収後にマイクロチューブを計量し、重量の差を測定時間で割った値を使用して流量を計算します(ここで、1 mg = 1 μL)。 ベースラインの安定化組織および/または細胞が組織チャンバーにロードされたら、システムを90分間平衡化させて、O2 消費量の平坦なベースラインを確立し、その時点で最初の試験化合物を注入できます(時間= 0と見なされます)。 最初の注入の 30 分前に、試験化合物の注入を準備するために、チャンネルあたりの直近の 3 FR の平均値を注入ページに入力します。 5.実験プロトコル(時間:2-6時間) 注:ベースラインの安定化が進んだら、次のタスクは、試験化合物を注入し、複数のプレートを使用する場合はフラクションコレクターのプレートを交換することです。 試験化合物注入液の調製化合物の名前、目的の濃度(最終溶液と原液)、および試験化合物の注入時間を、注入ページの UI の表に入力します。注入時に残されたMRMの容量や、所望の濃度にするために注入する原液の量など、プログラムに表示される情報を確認します(補足図4)。 注入に必要なペリフューセートとストックの量を計算するには、注入表の白いボックスに入力し、 計算をクリックします。計算値を使用して、注入前に試験化合物原液をペリフューセートで希釈し、注入後の MRM の注入量が MRM の体積の 5% になるようにします。 原液とペリフューセートを混合して各試験化合物を調製します。注入時間の少なくとも10分前にシリンジをロードし、注入の準備ができるまでCO2 インキュベーター(37〜40°Cの温度に維持)に保管します。. 試験化合物の注入試験化合物を含むシリンジを注入ラインに接続します(図9A)。注入ラインにつながる軟肉のパームチューブのクランプを外し、約 3 mL/分の速度で試験化合物(図 9B)をゆっくりと注入します。注入ラインでチューブを再クランプしてから、シリンジを取り外します(図9C)。MRM の反対側についても繰り返します。 各試験化合物を注入した後、UI注入ページに従って、注入する後続の各試験化合物を準備します。 各チャネルの流入O2 信号の決定各実験の最後に、呼吸抑制剤KCN(3 mM)を注入して、ベースラインセンサーの寿命とミトコンドリア以外の酸素消費量の変動を補正するために使用される各チャネルの流入寿命信号を決定します。 6. 実験終了とシステムの分解(所要時間:30分) 酸素データの保存酸素検知器ソフトウェアのグラフウィンドウの左上にある[ 保存 ]ボタンをクリックします。ファイルに名前を付けて、ファイルを保存するフォルダーに保存します。クリック 録音を停止 メインウィンドウのボタンをクリックして、バックアップファイルを保存します。 UI 実験的情報ファイルの保存UI の一般ページの左上にある [ プロファイルの保存 ] ボタンをクリックします。ファイルに名前を付けて、ファイルを保存するフォルダーに保存します。UI の [fraction & flow] ページで、[ Tools ] ドロップダウン メニューをクリックし、[ Save] をクリックします。生成された名前をそのまま使用するか、別の名前を選択して、必要な場所にファイルを保存します。必要に応じて、アクセスして保存できるバックアップファイルがあります。 楽器の分解KCNは揮発性であるため、流路系アセンブリーはドラフト内に廃棄してください。MRMおよびFC廃棄物トレイから廃棄物容器にメディアを注ぎ、MRMインサートと攪拌バーを水で完全にすすぎます。廃液容器(KCNを含む)の内容物をラベル付きの化学廃棄物容器に注ぎ、その後、化学物質の安全性によって廃棄します。次の実験の前に、攪拌子と鉗子を完全に洗浄してオートクレーブします。 7.データ処理(時間:15〜45分) MacまたはPCコンピュータでデータプロセッサアプリケーションを開きます。実験によって生成された .csv データ ファイルを選択します。この実験のプロトコルが以前に分析した実験と類似している場合は、その設定ファイルを選択して [次のステップ] をクリックします。それ以外の場合は、[ 次のステップ ] をクリックして、テストの設定の入力を開始します。 実験のさまざまな設定を入力します。基準時点の決定時に、KCN が発効し、ライフタイム値が減少する直前の時点を選択します。スライダーを使用するか、ボックスに時間値を入力して、このポイントを選択します。 計算をクリックして、式 2 に従って OCR グラフを生成します。OCR = ([O 2]in- [O 2]out) x FR = (217 nmol/mL – [O 2]out) x FR/組織基底 (式 2)ここで、37°Cで21%O2と平衡状態にあるときのKRB中のO2濃度は217 nmol/mL、FRは流量(mL/min)、組織基準はチャンバーにロードされた組織の量(すなわち、網膜、RPE-脈絡膜-強膜またはRPE細胞の数)である。 グラフを.pdfファイルとして保存するには、グラフの エクスポート ボタンを押します。OCRを絶対値として、または定常状態値の割合としてグラフ化するには、編集設定ページで1に設定する試験化合物に対応するボックスにチェックを入れます。 8. 流出画分のアッセイ 実験後すぐにサンプルをアッセイできない場合は、翌日アッセイする場合はプレートを4°Cに、長期間保存する場合は凍結してください。プレートが凍結している場合は、サンプルを4°Cで解凍します(サンプルが冷たく保たれるようにするため)。 選択した流出画分に対してアッセイが実行されると、データの列(チャネルごとに1つ)が.csvファイルに入力され、左端の列に時間(分)、右側の列に濃度(nmol/mLまたはng/mL)が入力されます。データ処理プログラム内のリンクを押すと、テンプレートがアップロードされます。 このファイルをデータ プロセッサにアップロードして、データを計算してプロットします。