תחזוקה והערכה של סוגי רקמות ותאים שונים של העין באמצעות מערכת חדשנית של Pumpless Fluidics
Summary
ניתוח בזמן אמת של רקמות חיות מניב נתונים פונקציונליים ומכניסטיים חשובים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים והמשתנים הקריטיים כדי להבטיח ייצור מדויק וניתן לשחזור של נתונים על ידי מערכת זרימה רב-ערוצית חדשנית ונטולת משאבות, השומרת ומעריכה מגוון רחב של מודלים של רקמות ותאיים.
Abstract
מודלים רבים במבחנה המשמשים לחקר תפקוד רקמות וביולוגיה של התא דורשים זרימה של מדיה כדי לספק חמצון הולם ותנאי תא אופטימליים הדרושים לשמירה על תפקוד וכדאיות. לשם כך, פיתחנו מערכת תרביות זרימה רב-ערוצית כדי לשמור על רקמות ותאים בתרבית ולהעריך ברציפות תפקוד וכדאיות על ידי חיישנים בתוך השורה ו/או אוסף של שברי זרימה. המערכת משלבת חישה אופטית רציפה בת 8 ערוצים של קצב צריכת חמצן עם קולט שברים מובנה כדי למדוד בו זמנית את קצב הייצור של מטבוליטים והפרשת הורמונים. למרות שהוא מסוגל לתחזק ולהעריך מגוון רחב של מודלים של רקמות ותאיים, כולל איונים, שרירים והיפותלמוס, כאן אנו מתארים את עקרונות הפעולה שלו ואת ההכנות/פרוטוקולים ניסיוניים שבהם השתמשנו כדי לחקור ויסות ביואנרגטי של רשתית עכבר מבודדת, אפיתל פיגמנט רשתית עכבר (RPE)-choroid-sclera, ותאי RPE אנושיים בתרבית. חידושים בתכנון המערכת, כגון זרימת נוזל ללא משאבה, הפיקו פעולה פשוטה מאוד של מערכת זרימה רב ערוצית. מוצגים סרטונים ותמונות הממחישים כיצד להרכיב, להכין את המכשיר לניסוי ולטעון את המודלים השונים של רקמות/תאים לתוך תאי הפריפיוזיה. בנוסף, מתוארים ונדונים קווים מנחים לבחירת תנאים לניסויים ספציפיים לפרוטוקול ולרקמות, כולל קביעת יחס קצב זרימה לרקמה נכון לקבלת תנאי תרבית עקביים ויציבים וקביעות מדויקות של קצב הצריכה והייצור. השילוב של תחזוקת רקמות אופטימלית והערכה בזמן אמת של פרמטרים מרובים מניב מערכי נתונים אינפורמטיביים ביותר שיהיו שימושיים מאוד למחקר בפיזיולוגיה של העין ולגילוי תרופות לטיפול בראייה לקויה.
Introduction
למערכות פריפיוז’ן יש היסטוריה ארוכה במדעי החיים. בפרט, לחקר תפקוד ההפרשה על ידי איונים, הם שימשו לאפיון הקינטיקה של הפרשת אינסולין בתגובה להפרשה1. בנוסף לאיסוף שברי זרימה לבדיקה עוקבת של הורמונים ומטבוליטים, שולבו חיישנים בזמן אמת, בעיקר לזיהוי צריכת חמצן 2,3,4. מאמצים נרחבים להבין טוב יותר מנגנונים המתווכים מחלות של העין הוגבלו על ידי מחסור בשיטות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית להערכת ויסות מטבולי וחוסר ויסות של המרכיבים המבודדים השונים של העין, כולל הרשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE)-choroid-sclera ותאי RPE בתרבית. מערכות סטטיות המיועדות לתאים בתרבית הותאמו לרקמה5, אך רקמה דורשת זרימה לצורך חמצון הולם. מערכות זרימה הצליחו למדוד באופן מדויק ומשכפל תגובות בזמן אמת בקצב צריכת החמצן (OCR) על ידי הרשתית ו- RPE-choroid-sclera, והרקמות נשארות יציבות מטבולית במשך יותר מ -8 שעות ומאפשרות פרוטוקולים אינפורמטיביים ביותר הכוללים תרכובות בדיקה מרובות 4,6,7,8,9 . עם זאת, הפעלת מערכות פלואידיקה דרשה באופן היסטורי מנגנון מותאם אישית וצוות טכני מיומן במתודולוגיות לא סטנדרטיות. מערכות כאלה לא אומצו כמתודולוגיה סטנדרטית ברוב המעבדות. BaroFuse היא מערכת פלואידיקה חדשה שפותחה ואינה מסתמכת על משאבות, אלא על לחץ גז כדי להניע זרימה דרך תעלות מרובות ותאי רקמות מרובים (איור 1). כל ערוץ מנוטר ברציפות עבור זיהוי תווים אופטי (OCR), והזרימה החוצה נאספת באמצעות אספן שברים מבוסס צלחת לבדיקה עוקבת של תוכן. חשוב לציין, תאי פריפיוז’ן הרקמה עבור המכשיר מתוכננים להכיל רקמות בגיאומטריות ובגדלים שונים.
לב המכשיר הוא מערכת הפלואידיקה, שבה הזרימה מועברת ממאגר אטום בלחץ דרך צינורות בקוטר פנימי קטן (ID) (התורמים את התנגדות הזרימה המשמעותית ביותר במעגל הנוזל) אל תאי רקמת הזכוכית המאחסנים את הרקמה. הלחץ למודול מאגר המדיה (MRM) מסופק על ידי וסתי לחץ נמוך ולחץ גבוה המחוברים לבלון גז המכיל תערובת גזים (בדרך כלל 21% O 2, 5% CO 2, איזון N2), והמאגר אטום מלמעלה על ידי מודול תא הפריפיוז’ן (PCM) המחזיק את מכלולי תאי הרקמה (TCAs). קצב הזרימה נשלט על ידי אורך ומזהה צינורות ההתנגדות והגדרת הלחץ של וסת לחץ נמוך. צינורות זרימה המחוברים לחלק העליון של תאי הרקמה מעבירים נוזל לכלי קיבול פסולת (שנשקל ברציפות לקביעה אוטומטית של קצב זרימה) או לבארות של צלחת בת 96 בארות הנשלטות על ידי קולט השברים. מערכת זיהוי O 2 מודדת את אורך החיים של צבע רגיש O2 הצבוע בחלק הפנימי של כל אחד מתאי רקמת הזכוכית במורד הזרם של הרקמה. מידע זה משמש לאחר מכן לחישוב רציף של זיהוי תווים אופטי (OCR). כל מערכת הפלואידיקה שוכנת במתחם מבוקר טמפרטורה ומיכל הגז, קולט השברים והמחשב הם המרכיבים העיקריים של המכשיר (איור 2A). לבסוף, תוכנה המפעילה את המכשיר משמשת לבקרה על פעולתו (כולל הכנה ותזמון של תרכובות בדיקה מוזרקות, מערכת מדידת זרימה ותזמון אספן שברים), כמו גם עיבוד וגרפים של נתוני OCR ומדידות משלימות אחרות.
במאמר זה אנו מתארים את הפרוטוקולים לשימוש במערכת הפלואידיקה כדי לשבור ולהעריך OCR וקצב ייצור לקטט (LPR) עבור רכיבים מבודדים שונים של העין. LPR הוא פרמטר המשקף קצב גליקוליטי המשלים מאוד את OCR, שבו הצמד מהווה את שני הענפים העיקריים של ייצור אנרגיה מפחמימות בתא10. מכיוון שהכנת הרקמה והטענתה לתאי הרקמה נלמדת בצורה הטובה ביותר על ידי צפייה בהליך, הסרטון יסייע להמחיש כמה מהשלבים הקריטיים המבוצעים במהלך ההתקנה והתפעול שאינם מועברים בקלות על ידי טקסט בלבד.
תיאור הפרוטוקול מחולק ל-8 חלקים המתאימים לשלבים שונים של הניסוי (איור 2B): 1. הכנה טרום-ניסויית; 2. הכנה/שיווי משקל של הפריפוסט; 3. הגדרת מכשיר; 4. שיווי משקל רקמות; 5. פרוטוקול ניסיוני; 6. שבירת מכשירים; 7. עיבוד נתונים; ו-8. בדיקות של שברים יוצאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל חשיבותה של הביו-אנרגטיקה בכל היבטי תפקוד התא ותחזוקת מרכיבי העין השונים, קיים צורך קריטי בשיטות לחקר ויסותה. בפרט, הרשתית העצבית ו- RPE תלויים בחילוף החומרים הן לייצור אנרגיה והן לאיתות תוך תאיובין-תאי 14,15,16,17. בגלל יכולת החמצון הגבוהה שלהן, רקמות מבודדות של העין אינן מתוחזקות היטב בתנאים סטטיים18,19 ולכן מחקר של רכיבים מבודדים של העין דורש מערכות זרימה שיכולות גם לשמור וגם להעריך תהליכים מטבוליים. מערכת הפלואידיקה פותחה כדי להפיק נתוני OCR ו-LPR ממגוון רחב של סוגי רקמות, ובמאמר זה הצגנו פרוטוקולים מפורטים שנמצאו כמניבים תוצאות אופטימליות.
הגורם העיקרי להפקת נתונים חזקים באמצעות מערכת הזרימה כולל שיווי משקל מראש של מדיה/חיץ מבוסס CO2 ב-39°C (כדי להבטיח שהפריפוזאט אינו רווי בגז מומס שירד מהגז במהלך הניסוי). בפרט, מדיה או חיץ KRB המאוחסנים ב -4 ° C יהיו רוויים ביחס ל -37 ° C וירדו מהגז במהלך הניסוי אם זמני טרום שיווי משקל אינם מספיקים. בנוסף, אסור שהרקמה המועמסת לתוך תאי הרקמה תעבור טראומה על ידי בידוד לא תקין של רקמה עקב קריעה או הפרדה לא מלאה של רקמה, או על ידי חשיפת רקמה בכמות נמוכה של חיץ מבוסס ביקרבונט לאוויר האטמוספרי למשך זמן רב מדי. בקרת הטמפרטורה, יציבות הזרימה והאמינות של זיהוי O2 הם בעלי שונות מועטה וגורמים אלה אינם תורמים באופן משמעותי לשיעור הכשלים.
למכשיר שמונה תעלות זרימה / תאי רקמה הפועלים בו זמנית המסופקים עם פריפוזט משני מאגרים, ארבעה תאי רקמה לכל מאגר. כדי לקבל את מסלולי הזמן המדויקים ביותר של OCR, עקומות קינטיות מתוקנות על ידי תאים שאינם עמוסים ברקמות. לפיכך, פרוטוקול ניסויי טיפוסי יכלול שתי קבוצות של שלושה תאי רקמה. פרוטוקולים באופן כללי מתחלקים לשתי קטגוריות: האחת היא פרוטוקולי תרכובת הבדיקה השונים בכל צד (למשל תרופה/רכב בצד אחד של MRM, ורק רכב בצד השני); השני הוא אותו פרוטוקול הזרקת תרכובת בדיקה משני צידי ה-MRM, אך מודל רקמות או רקמות שונה בכל צד של ה-MRM. במאמר זה, ההשפעות של אוליגומיצין ו-FCCP על הרשתית הושוו ל-OCR על ידי רקמות שלא נחשפו לתרכובות בדיקה כלשהן, ושתי רקמות הוערכו במקביל תחת אותו פרוטוקול ותנאים לזיהוי התנהגות ספציפית לרקמה. האחרון הודגם במחקר זה על ידי הצגת טווח דינמי מוגבר של קצב חילוף החומרים על ידי RPE-choroid-sclera ביחס לרשתית במקביל באותו ניסוי. דוחות אחרים תיארו מגוון רחב יותר של תכנוני מחקר, כולל מדידת ההשפעות המשתנות של רמות O2 על OCR ו- LPR, ותלות בריכוז של דלקים, תרופות ורעלים20,21. בנוסף, למרות שהגבלנו את הניתוח של שברים החוצה למדידת לקטט וחישוב של LPR, תוכן המידע של ניסוי גדל מאוד אם תרכובות מרובות וסוגים של תרכובות בשברים החוצה נבדקים כגון הורמונים, נוירוטרנסמיטרים, אותות תאיים, מטבוליטים שיכולים לצאת התאים20,22, 23.
ההעמסה של רשתית מבודדת או RPE-choroid-sclera היא פשוטה, ולאחר בידוד רקמות אלה פשוט ממוקמים בחלק העליון של חדרי הרקמה עם מלקחיים ומותר לשקוע למטה אל frit. תאי RPE בתרבית על תוספות מסנן מפתחים קיטוב מתאים וסמנים של בשלות RPE לאחר 4-8 שבועות בתרבית. אין זה ריאלי להסיר את RPE לאנליזה של תאים חיים לאחר חיבורו לקרום הטרנסוול, אם יש לשמור על בשלות וקיטוב RPE24. תא הפריפוזיה יכול להכיל רצועות של קרום הטרנסוול שנחתכות באזמל בזמן שהן שקועות בחיץ ומוחדרות במהירות לתאי הרקמה. למרות שחיתוך רצועות מסנן הוכנס למערכת סטטית24, אין שיטה אחרת להערכת סוגי תאים חשובים אלה. התגובות של תאי RPE היו מהירות ודינמיות יותר מאשר הרשתית או RPE-choroid-sclera, ככל הנראה בשל גישה מיידית של שני ההיבטים האפיקליים והבזאליים של תאי RPE שהוגדרו כשכבה אחת על תוספת הממברנה.
גורם נוסף המבטיח שלנתונים יש את האות הגבוה ביותר לרעש הוא בחירת היחס האופטימלי של הרקמה המוטענת לתאי הפריפיוז’ן ביחס לקצב הזרימה. מעט מדי רקמה ביחס לקצב הזרימה גורמת להפרש של ריכוז O2 מומס בין זרימה לזרימה החוצה שהוא קטן מאוד וקשה למדוד אותו בצורה אמינה. לעומת זאת, אם הזרימה איטית מדי, אז הריכוז של O2 הופך להיות כל כך נמוך כי הרקמה מושפעת היפוקסיה. עם זאת, זרימת נוזל מונעת לחץ גז יכולה להישמר בקצבי זרימה של עד 5 מ”ל / דקה הדורשים רק כמויות קטנות של רקמה למדידות OCR ו- LPR מדויקות. בניסויים המוצגים כאן, נעשה שימוש בכ-20 מ”ל/דקה/תעלה שהתאימו לרשתית אחת, לשני תאי RPE-choroid-scleras, או ל-360,000 תאי RPE. כדי למזער את השפעות המערכת המעכבות ומפזרות את חשיפת הרקמה לתרכובת הבדיקה המוזרקת, מסופקים גדלים מרובים של תאי הרקמה, כך שכמות הרקמה (וקצב הזרימה) מותאמים לגודל המתאים של החדר.
הנתונים מהניתוחים המוצגים במאמר זה יוצגו בשתי דרכים: גודל מוחלט ביחס לקצב, או שינויים חלקיים ביחס למצב יציב או קו בסיס. ההתמקדות הייתה בהמחשה של מדידת תגובות לתרכובות בדיקה. עם זאת, מערכת הפלואידיקה מתאימה היטב להעריך ולהשוות השפעות של טיפול ברקמות לפני ניתוח פריפוזיה כגון שינויים גנטיים. בדיקה אם טיפול שונה משליטה היא חזקה ביותר אם מנותחות השפעות הטיפול על תגובות מנורמלות של תרכובות בדיקה. אם הניתוח דורש סדרי גודל מוחלטים, הכוח הסטטיסטי של ניתוחי הדגימות המטופלות מראש הוא מקסימלי אם הערכתם והבקרות שלהם מתבצעות באותו ניסוי פריפיוז’ן.
למעט הבוחש, כל החלקים הבאים במגע עם נוזל מסופקים על ידי היצרן כחומרים מתכלים ועברו עיקור. אין לעשות שימוש חוזר בחלקים אלה, מכיוון שניסויים יאבדו מדי פעם עקב ניקוי לא שלם ומשטחים מזוהמים. המערכת בתחילת ההתקנה היא סטרילית. עם זאת, התקשורת מתווספת ל- MRM, ורקמות נטענות בתאים בתנאים לא סטריליים. מדדנו OCR במערכת שמורכבת מחלקים סטריליים, אך הניסוי עצמו מתבצע בתנאים לא סטריליים. לוקח בערך 14 שעות לחיידקים להצטבר עד כדי כך שיש OCR מדיד (תוצאות שלא פורסמו). אם משתמשים בפרוטוקולים שהם פחות מ -10 שעות בערך, אז הצטברות של חיידקים וכל ההשפעות הנובעות מהם יהיו זניחים.
חוקרים רבים משתמשים במכשירים שנועדו למדוד OCR תחת דגירה סטטית של שכבה אחת של תאים עם תפוקה גבוהה יחסית25,26. לעומת זאת, מכשיר הפלואידיקה שבדקנו ותיארנו במאמר זה שומר על הרקמה על ידי הבטחת אספקת O2 נאותה, שהיא קריטית למרחקי הדיפוזיה הגדולים יותר הנמצאים בדגימות רקמה. בנוסף, הוא מסוגל לאסוף שברים המאפשר הערכה של פרמטרים מרובים במקביל OCR אשר משפר מאוד את היכולת לחקור את היחסים ביניהם. לבסוף, ניתן לשלוט בריכוזי הגזים המומסים (כגון O 2 ו-CO 2), מה שמגדיל את משך הניסויים עם מדיה וחיץ מבוססי ביקרבונט, מה שמאפשר למשתמש לחקור את ההשפעות של O2. יש לציין, מגבלה עבור שתי המתודולוגיות היא חוסר היכולת לחקור את השטיפה של תרכובות בדיקה, פונקציונליות כי מערכות perifusion אחרים יש 4,27,28. שיקול נוסף בקביעת שיטת הניתוח האופטימלית הוא העובדה שמערכות פלואידיקה משתמשות ביותר מדיה ותרכובות בדיקה מאשר מערכות סטטיות. ההוצאה הנוספת ממוזערת עם מערכות הפלואידיקה הנוכחיות, אם כי בשל שיעורי הזרימה הנמוכים שניתן להשתמש במערכת.
בסך הכל, מתואר תיאור מפורט של הפרוטוקולים לביצוע ניסויים עם מכשיר זרימה/הערכה חדש. נתונים שנוצרו עם רשתית ו- RPE-choroid-sclera חזרו על תוצאות קודמות שהתקבלו עם מערכות שהן הרבה יותר קשות לשימוש (ולא זמינות). כמו כן הוכח כי המערכת יכולה לשמור ולהעריך תאי RPE המחוברים לממברנות טרנסוול, מודל תאי חשוב מאוד שלא נותח בעבר עם מערכות זרימה בשל שבריריות התאים. חלקיו העיקריים של הפרוטוקול מורכבים מזמן התקנה של 75 דקות, ואחריו תקופת שיווי משקל של 90 דקות והפרוטוקול הניסיוני שהופך אותו למתאים לשימוש שגרתי על ידי מעבדות שאינן מתמחות בהפעלת מערכות פלואידיקה. למרות שהתמקדנו במדידת התגובה החריפה של רקמה לבדיקת תרכובות, המערכת מתאימה מאוד להשוואת רקמות ממקורות שונים כגון מודלים של בעלי חיים או מודלים של תאים ששונו גנטית או עברו טיפולים/מצבים ניסיוניים. בנוסף, היקף הבדיקות שניתן לבצע על שברי הזרימה הוא רחב וכולל מטבוליטים, מולקולות איתות תאיות והורמונים / מוליכים עצביים המופרשים וכן אנליזה מרובת רכיבים הנוצרת על ידי ספקטרומטריית מסות על השברים כמו גם על הרקמה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, קרן BrightFocus, מחקר למניעת עיוורון (J.R.C.) ו- R01 EY006641, R01 EY017863 ו- R21 EY032597 (J.B.H).
Materials
| BIOLOGICAL SAMPLES | |||
| C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
| REAGENTS | |||
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
| KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
| Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
| Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
| CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
| Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
| Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
| Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
| Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
| SUPPLIES | |||
| Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
| Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
| COMMERCIAL ASSAYS | |||
| Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
| Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
| Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
| EQUIPMENT | |||
| BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
| Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |
References
- Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin. Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).
- Doliba, N. M., et al. Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).
- Sweet, I. R., et al. Regulation of ATP/ADP in pancreatic islets. Diabetes. 53 (2), 401-409 (2004).
- Chertov, A. O., et al. Roles of glucose in photoreceptor survival. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34700-34711 (2011).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Bisbach, C. M., et al. Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium. Cell Reports. 31 (5), 107606 (2020).
- Du, J., et al. Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina. The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).
- Hass, D. T., et al. Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis. Cell Reports. 39 (10), 110917 (2022).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, e66716 (2021).
- Stryer, L. . Biochemistry. , (1995).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Engel, A. L., et al. Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium. Experimental Eye Research. 215, 108899 (2022).
- Zhang, R., et al. Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium. Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).
- Hurley, J. B. Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection. Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).
- Xiao, J., et al. Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment. Experimental Eye Research. 205, 108492 (2021).
- Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light. Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. , 100846 (2020).
- Yu, J., et al. Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives. Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842 (2023).
- Arjamaa, O., Nikinmaa, M. Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors. Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).
- Kamat, V., et al. A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells. Cell Reports Methods. In Press. , (2023).
- Neal, A., et al. Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate. Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).
- Jung, S. R., et al. Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).
- Rountree, A. M., et al. Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity. Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).
- Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).
