Linksatriale Ligatur im aviären Embryo als Modell für veränderte hämodynamische Belastung während der frühen Gefäßentwicklung
Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes visuelles Protokoll für die Durchführung des Modells der linksatrialen Ligatur (LAL) im Vogelembryo vor. Das LAL-Modell verändert den intrakardialen Fluss, was die Belastung durch Wandscherspannung verändert und das hypoplastische Linksherzsyndrom nachahmt. Es wird ein Ansatz vorgestellt, um die Herausforderungen dieses schwierigen mikrochirurgischen Modells zu bewältigen.
Abstract
Aufgrund seiner vierkammerigen reifen ventrikulären Konfiguration, der einfachen Kultur, des Zugangs zur Bildgebung und der Effizienz ist der Vogelembryo ein bevorzugtes Wirbeltiermodell für die Untersuchung der kardiovaskulären Entwicklung. Studien, die darauf abzielen, die normale Entwicklung und die Prognose von angeborenen Herzfehlern zu verstehen, übernehmen dieses Modell in großem Umfang. Mikroskopische Operationstechniken werden eingeführt, um die normalen mechanischen Belastungsmuster zu einem bestimmten embryonalen Zeitpunkt zu verändern und die nachgeschaltete molekulare und genetische Kaskade zu verfolgen. Die häufigsten mechanischen Eingriffe sind die Ligatur der linken Vitellinvene, das konotrunkale Band und die linksatriale Ligatur (LAL), die den intramuralen Gefäßdruck und die Wandscherbelastung aufgrund des Blutflusses moduliert. Die LAL ist, insbesondere wenn sie in ovo durchgeführt wird, der anspruchsvollste Eingriff, mit sehr geringen Probenausbeuten aufgrund der extrem feinen sequentiellen mikrochirurgischen Eingriffe. Trotz seines hohen Risikos ist LAL in ovo wissenschaftlich sehr wertvoll, da es die Pathogenese des hypoplastischen Linksherzsyndroms (HLHS) nachahmt. HLHS ist ein klinisch relevanter, komplexer angeborener Herzfehler, der bei menschlichen Neugeborenen beobachtet wird. Ein detailliertes Protokoll für in ovo LAL ist in diesem Artikel dokumentiert. Kurz gesagt, befruchtete Vogelembryonen wurden bei 37,5 °C und 60 % konstanter Luftfeuchtigkeit inkubiert, typischerweise bis sie die Hamburger-Hamilton (HH)-Stadien 20 bis 21 erreichten. Die Eierschalen wurden aufgebrochen und die äußere und innere Membran entfernt. Der Embryo wurde vorsichtig gedreht, um den linken Vorhofkolben des gemeinsamen Vorhofs freizulegen. Vormontierte Mikroknoten aus 10-0 Nylonnähten wurden vorsichtig positioniert und um die linke Vorhofknospe gebunden. Schließlich wurde der Embryo in seine ursprüngliche Position zurückgebracht und die LAL war abgeschlossen. Normale und LAL-instrumentierte Ventrikel zeigten statistisch signifikante Unterschiede in der Gewebeverdichtung. Eine effiziente Pipeline zur Generierung von LAL-Modellen würde zu Studien beitragen, die sich auf synchronisierte mechanische und genetische Manipulation während der embryonalen Entwicklung kardiovaskulärer Komponenten konzentrieren. Ebenso wird dieses Modell eine gestörte Zellquelle für die Gewebekulturforschung und die Gefäßbiologie darstellen.
Introduction
Angeborene Herzfehler (KHK) sind strukturelle Störungen, die aufgrund einer abnormen Embryonalentwicklung auftreten1. Neben genetischen Gegebenheiten wird die Pathogenese durch veränderte mechanische Belastung beeinflusst 2,3. Das hypoplastische Linksherzsyndrom (HLHS), ein angeborener Herzfehler, führt zu einer unterentwickelten Herzkammer/Aorta bei der Geburt4 mit einer hohen Mortalitätsrate 5,6. Trotz der jüngsten Fortschritte in der klinischen Behandlung sind das Gefäßwachstum und die Entwicklungsdynamik des HLHS noch unklar7. In der normalen Embryonalentwicklung stammen das Endokard und das Myokard des linken Ventrikels (LV) von kardialen Vorläuferzellen ab, während die frühe embryonale Herzröhrenbildung fortschreitet. Das allmähliche Vorhandensein von myokardialer Trabekulation, Verdickungsschichten und Kardiomyozytenproliferation wird berichtet2. Beim HLHS werden ein verändertes trabekuläres Remodeling und eine linksventrikuläre Abflachung beobachtet, was aufgrund einer abnormen Kardiomyozytenmigration weiter zur myokardialen Hypoplasie beiträgt 2,8,9,10
Unter den weit verbreiteten Modellorganismen zur Untersuchung der Herzentwicklung und zum Verständnis hämodynamischer Bedingungen 11 wird der Vogelembryo aufgrund seines vierkammerigen reifen Herzens und seiner einfachen Kultivierbarkeit bevorzugt11,12,13,14. Auf der anderen Seite bietet der erweiterte Zugang zur Bildgebung von Zebrafischembryonen und transgenen/Knockout-Mäusen deutliche Vorteile11,12. Für den Vogelembryo wurden verschiedene mechanische Eingriffe getestet, die den intramuralen Druck und die Wandscherspannung bei der Entwicklung kardiovaskulärer Komponenten verändern. Zu diesen Modellen gehören die linke Vitellin-Ligatur, das konotrunkale Banding15 und die linksatriale Ligatur (LAL)11,12,16. Der resultierende Phänotyp aufgrund der veränderten mechanischen Belastung kann ca. 24-48 h nach dem chirurgischen Eingriff in Studien beobachtet werden, die sich auf die frühe Prognose konzentrieren11,13. Die LAL-Intervention ist eine beliebte Technik, um das funktionelle Volumen des linken Vorhofs (LA) zu verengen, indem eine Nahtschlaufe um die atrioventrikuläre Öffnung gelegt wird. Ebenso wurden mikrochirurgische Eingriffe durchgeführt, die auf die rechtsatriale Ligatur (RAL) abzielen17,18. In ähnlicher Weise zielen einige Forscher mit Mikroclips auf das linke Vorhofohr (LAA) ab, um das Volumen des LA19,20 zu reduzieren. In einigen Studien wird ein chirurgischer Nylonfaden auf den atrioventrikulären Knoten19,21 aufgebracht. Eine der verwendeten Interventionen ist LAL, die HLHS nachahmen kann, aber auch das am schwierigsten durchzuführende Modell ist, mit sehr geringen Probenausbeuten aufgrund der extrem feinen mikrochirurgischen Eingriffe, die erforderlich sind. In unserem Labor wird die LAL in ovo zwischen den Hamburger-Hamilton (HH) Stadien 20 und 21 durchgeführt, bevor der gemeinsame Vorhof vollständig septiert ist 6,14,22,23. Um das LA herum wird eine chirurgische Naht gelegt, die den intrakardialen Blutfluss verändert. In LAL-Modellen des HLHS werden eine erhöhte Ventrikelwandsteifigkeit, veränderte Myofaserwinkel und eine verringerte LV-Hohlraumgröße beobachtet14,24.
In diesem Videoartikel wird ein detailliertes Protokoll und eine Vorgehensweise für in ovo LAL bereitgestellt. Kurz gesagt, die befruchteten Vogelembryonen wurden für die Mikrochirurgie inkubiert, die Eierschale aufgebrochen und die äußere und innere Membran gereinigt. Der Embryo wurde dann langsam gedreht, so dass die LA zugänglich war. Eine chirurgische 10:0-Nylonnaht wurde an die Vorhofknospe gebunden, und der Embryo wurde in seine ursprüngliche Ausrichtung zurückgebracht, wodurch das LAL-Verfahrenabgeschlossen wurde 25. LAL- und Normalventrikel werden mittels optischer Kohärenztomographie und Basishistologie auf Gewebeverdichtung und Ventrikelvolumen verglichen.
Eine erfolgreich durchgeführte LAL-Modellpipeline, wie hier beschrieben, wird zu Grundlagenstudien beitragen, die sich auf die embryonale Entwicklung kardiovaskulärer Komponenten konzentrieren. Dieses Modell kann auch zusammen mit genetischen Manipulationen und fortschrittlichen Bildgebungsmodalitäten verwendet werden. Ebenso ist das akute LAL-Modell eine stabile Quelle für erkrankte Gefäßzellen für Gewebekulturexperimente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beim HLHS ist der Blutfluss aufgrund struktureller Defekte verändert, was zu einer abnormen Morphologie auf der linken Seite führt 4,6. Das vorliegende Modell bietet ein praktisches experimentelles System, um das Fortschreiten des HLHS besser zu verstehen und könnte sogar seine Pathogenese nachahmen8. Die Etablierung eines vollständig klinisch äquivalenten HLHS-Tiermodells ist jedoch eine herausfordernde Aufgabe. Zusätzlich zu dem hi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Tubitak 2247A Lead Researcher Award 120C139 für die Bereitstellung von Fördermitteln. Die Autoren bedanken sich auch bei PakTavuk Gıda. A. S., Istanbul, Türkei, für die Bereitstellung befruchteter Eizellen und die Unterstützung der kardiovaskulären Forschung.
Materials
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
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