La ligature auriculaire gauche chez l’embryon aviaire comme modèle de modification de la charge hémodynamique au cours du développement vasculaire précoce
Summary
Nous présentons ici un protocole visuel détaillé pour l’exécution du modèle de ligature auriculaire gauche (LAL) dans l’embryon aviaire. Le modèle LAL modifie le flux intracardiaque, ce qui modifie la charge de contrainte de cisaillement de la paroi, imitant le syndrome hypoplasique du cœur gauche. Une approche pour surmonter les défis de ce modèle difficile de microchirurgie est présentée.
Abstract
En raison de sa configuration ventriculaire mature à quatre chambres, de sa facilité de culture, de son accès à l’imagerie et de son efficacité, l’embryon aviaire est un modèle animal vertébré privilégié pour étudier le développement cardiovasculaire. Les études visant à comprendre le développement normal et le pronostic des malformations cardiaques congénitales adoptent largement ce modèle. Des techniques chirurgicales microscopiques sont introduites pour modifier les schémas de charge mécanique normaux à un moment embryonnaire spécifique et suivre la cascade moléculaire et génétique en aval. Les interventions mécaniques les plus courantes sont la ligature de la veine vitelline gauche, la pose de bandes conotruncales et la ligature auriculaire gauche (LAL), modulant la pression vasculaire intra-muros et la contrainte de cisaillement de la paroi due au flux sanguin. La LAL, en particulier si elle est réalisée in ovo, est l’intervention la plus difficile, avec des rendements d’échantillons très faibles en raison des opérations microchirurgicales séquentielles extrêmement fines. Malgré son risque élevé, l’in ovo LAL est très précieux scientifiquement car il imite la pathogenèse du syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS). Le SHLH est une cardiopathie congénitale complexe cliniquement pertinente observée chez les nouveau-nés humains. Un protocole détaillé pour la LAL in ovo est documenté dans cet article. Brièvement, les embryons aviaires fécondés ont été incubés à 37,5 °C et à 60 % d’humidité constante, généralement jusqu’à ce qu’ils atteignent les stades 20 à 21 de Hamburger-Hamilton (HH). Les coquilles d’œufs ont été ouvertes et les membranes externe et interne ont été retirées. L’embryon a été doucement tourné pour exposer le bulbe auriculaire gauche de l’oreillette commune. Des micro-nœuds pré-assemblés à partir de sutures en nylon 10-0 ont été délicatement positionnés et attachés autour du bourgeon auriculaire gauche. Finalement, l’embryon a été remis dans sa position d’origine et la LAL a été complétée. Les ventricules normaux et instrumentés par LAL ont montré des différences statistiquement significatives dans le compactage des tissus. Un pipeline efficace de génération de modèles LAL contribuerait à des études axées sur les manipulations mécaniques et génétiques synchronisées au cours du développement embryonnaire des composants cardiovasculaires. De même, ce modèle fournira une source de cellules perturbées pour la recherche sur la culture tissulaire et la biologie vasculaire.
Introduction
Les cardiopathies congénitales (CHD) sont des troubles structurels qui surviennent en raison d’un développement embryonnaire anormal1. En plus des conditions génétiques, la pathogenèse est influencée par une altération de la charge mécanique 2,3. Le syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS), une cardiopathie congénitale, se traduit par un ventricule ou une aorte sous-développés à la naissance4 avec un taux de mortalité élevé 5,6. Malgré les progrès récents dans sa prise en charge clinique, la dynamique de croissance et de développement vasculaire du HLHS n’est toujours pas claire7. Au cours du développement embryonnaire normal, l’endocarde et le myocarde du ventricule gauche (VG) proviennent de progéniteurs cardiaques au fur et à mesure que la formation embryonnaire précoce du tube cardiaque progresse. La présence progressive d’une trabéculation myocardique, de couches d’épaississement et d’une prolifération des cardiomyocytes est rapportée2. Dans le cas du SHHS, une altération du remodelage trabéculaire et un aplatissement du ventricule gauche sont observés, ce qui contribue davantage à l’hypoplasie myocardique due à une migration anormale des cardiomyocytes 2,8,9,10
Parmi les organismes modèles largement utilisés pour étudier le développement du cœur et comprendre les conditions hémodynamiques 11, l’embryon aviaire est préféré en raison de son cœur mature à quatre chambres et de sa facilité de culture11,12,13,14. D’autre part, l’accès avancé à l’imagerie des embryons de poisson-zèbre et des souris transgéniques/knock-out offre des avantages distincts11,12. Diverses interventions mécaniques ont été testées pour l’embryon aviaire qui modifient la pression intra-muros et la contrainte de cisaillement de la paroi dans le développement des composants cardiovasculaires. Ces modèles comprennent la ligature vitelline gauche, la ligature conotruncale15 et la ligature auriculaire gauche (LAL)11,12,16. Le phénotype résultant de l’altération de la charge mécanique peut être observé environ 24 à 48 h après l’intervention chirurgicale dans les études axées sur le pronostic précoce11,13. L’intervention LAL est une technique populaire pour rétrécir le volume fonctionnel de l’oreillette gauche (LA) en plaçant une boucle de suture autour de l’ouverture auriculo-ventriculaire. De même, des interventions microchirurgicales ont également été réalisées pour cibler la ligature auriculaire droite (RAL)17,18. De même, certains chercheurs ciblent l’appendice auriculaire gauche (LAA) à l’aide de micro-clips pour réduire le volume du LA19,20. Dans certaines études, un fil de nylon chirurgical est appliqué sur le nœud auriculo-ventriculaire19,21. L’une des interventions utilisées est le LAL, qui peut imiter le HLHS mais qui est aussi le modèle le plus difficile à réaliser, avec des rendements d’échantillons très faibles en raison des opérations microchirurgicales extrêmement fines requises. Dans notre laboratoire, la LAL est réalisée in ovo entre les stades 20 et 21 de Hamburger-Hamilton (HH), avant que l’oreillette commune ne soit complètement cloisonnée 6,14,22,23. Une suture chirurgicale est placée autour de l’AL, ce qui modifie les flux sanguins intracardiaques. Dans les modèles LAL de HLHS, on observe une augmentation de la rigidité de la paroi ventriculaire, une modification des angles des myofibres et une diminution de la taille de la cavité VG14,24.
Dans cet article vidéo, un protocole et une approche détaillés pour la LAL in ovo sont fournis. Brièvement, les embryons aviaires fécondés ont été incubés pour la microchirurgie, la coquille de l’œuf a été ouverte et les membranes externe et interne ont été dégagées. L’embryon a ensuite été lentement tourné afin que le LA soit accessible. Une suture chirurgicale en nylon 10-0 a été attachée au bourgeon auriculaire et l’embryon a été ramené à son orientation initiale, complétant ainsi la procédure LAL25. Les ventricules LAL et normaux sont comparés pour la compaction tissulaire et le volume du ventricule par tomographie par cohérence optique et histologie de base.
Un pipeline de modèles LAL exécuté avec succès, tel que décrit ici, contribuera à des études fondamentales axées sur le développement embryonnaire des composants cardiovasculaires. Ce modèle peut également être utilisé avec des manipulations génétiques et des modalités d’imagerie avancées. De même, le modèle LAL aiguë est une source stable de cellules vasculaires malades pour les expériences de culture tissulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le HLHS, le flux sanguin est altéré en raison de défauts structurels, conduisant à une morphologie anormale du côté gauche 4,6. Le présent modèle fournit un système expérimental pratique pour mieux comprendre la progression du HLHS et peut même imiter sa pathogenèse8. Cependant, l’établissement d’un modèle animal HLHS entièrement équivalent sur le plan clinique est une tâche difficile. En plus du modèle LAL aviai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le prix Tubitak 2247A pour le chercheur principal 120C139 qui a fourni un financement. Les auteurs tiennent également à remercier PakTavuk Gıda. A. S., Istanbul, Turquie, pour avoir fourni des ovules fertiles et soutenu la recherche cardiovasculaire.
Materials
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
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