קשירת פרוזדורים שמאלית בעובר העופות כמודל לשינוי עומס המודינמי במהלך התפתחות כלי הדם המוקדמת
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול חזותי מפורט לביצוע מודל קשירת פרוזדורים שמאלית (LAL) בעובר העופות. מודל LAL משנה את הזרימה התוך-לבבית, אשר משנה את העמסת הלחץ של גזירת הקיר, ומחקה תסמונת לב שמאל היפופלסטית. מוצגת גישה להתגבר על האתגרים של מודל מיקרוכירורגיה קשה זה.
Abstract
בשל תצורת החדר הבוגר בעל ארבעת החדרים, קלות התרבית, הגישה להדמיה והיעילות, עובר העופות הוא מודל מועדף של בעלי חוליות לחקר התפתחות הלב וכלי הדם. מחקרים שמטרתם להבין את ההתפתחות התקינה ואת הפרוגנוזה של מומי לב מולדים מאמצים באופן נרחב מודל זה. טכניקות כירורגיות מיקרוסקופיות מוצגות כדי לשנות את דפוסי ההעמסה המכנית הרגילים בנקודת זמן עוברית ספציפית ולעקוב אחר המפל המולקולרי והגנטי במורד הזרם. ההתערבויות המכניות הנפוצות ביותר הן קשירת ורידים ויטלין שמאלי, פסים קונוטרונליים וקשירת פרוזדורים שמאלית (LAL), המווסתים את לחץ כלי הדם התוך-גווארי ואת לחץ הגזירה בקיר עקב זרימת הדם. LAL, במיוחד אם היא מבוצעת באובו, היא ההתערבות המאתגרת ביותר, עם תפוקת דגימות קטנה מאוד בשל הפעולות המיקרוכירורגיות הרציפות העדינות ביותר. למרות הסיכון הגבוה שלה, ב ovo LAL הוא בעל ערך מדעי רב כפי שהוא מחקה hypoplastic תסמונת הלב השמאלי (HLHS) פתוגנזה. HLHS היא מחלת לב מולדת מורכבת ורלוונטית מבחינה קלינית שנצפתה ביילודים אנושיים. פרוטוקול מפורט עבור in ovo LAL מתועד במאמר זה. בקצרה, עוברי עופות מופרים הודגרו בטמפרטורה של 37.5 מעלות צלזיוס ולחות קבועה של 60%, בדרך כלל עד שהגיעו לשלבי המבורגר-המילטון (HH) 20 עד 21. קליפות הביצים נסדקו והקרומים החיצוניים והפנימיים הוסרו. העובר סובב בעדינות כדי לחשוף את פקעת הפרוזדורים השמאלית של האטריום המשותף. מיקרו-קשרים שהורכבו מראש מתפרי ניילון 10-0 מוקמו בעדינות ונקשרו סביב ניצן הפרוזדורים השמאלי. לבסוף, העובר הוחזר למקומו המקורי, ו-LAL הושלם. חדרים תקינים ו-LAL הדגימו הבדלים מובהקים סטטיסטית בדחיסת הרקמות. צינור ייצור יעיל של מודל LAL יתרום למחקרים המתמקדים במניפולציה מכנית וגנטית מסונכרנת במהלך ההתפתחות העוברית של רכיבים קרדיווסקולריים. כמו כן, מודל זה יספק מקור תאים מוטרד למחקר תרביות רקמות וביולוגיה של כלי הדם.
Introduction
מומי לב מולדים (CHDs) הם הפרעות מבניות המתרחשות עקב התפתחות עוברית לא תקינה1. בנוסף לתנאים גנטיים, הפתוגנזה מושפעת מעומס מכני משתנה 2,3. תסמונת לב שמאל היפופלסטית (HLHS), מחלת לב מולדת, גורמת לחדר / אבי העורקים לא מפותח בלידה4 עם שיעור תמותה גבוה 5,6. למרות ההתקדמות האחרונה בניהול הקליני שלה, צמיחת כלי הדם ודינמיקת ההתפתחות של HLHS עדיין לא ברורים7. בהתפתחות עוברית תקינה, אנדוקרדיום החדר השמאלי (LV) ושריר הלב מקורם באבות הלב עם התקדמות היווצרות צינור הלב העוברי המוקדם. נוכחות הדרגתית של טרבקולציה שריר הלב, שכבות עיבוי, והתפשטות cardiomyocyte מדווח2. עבור HLHS, שינוי trabecular remodeling ו flattening החדר השמאלי נצפים, תורם עוד יותר hypoplasia שריר הלב עקב נדידת cardiomyocyte חריג 2,8,9,10
מבין יצורי המודל הנפוצים לחקר התפתחות הלב ולהבנת מצבים המודינמיים 11, עובר העופות מועדף בשל ליבו הבוגר בעל ארבעת החדרים וקלות התרבית שלו11,12,13,14. מצד שני, גישה מתקדמת להדמיה של עוברי דגי זברה ועכברים טרנסגניים/נוקאאוט מספקת יתרונות ברורים11,12. התערבויות מכניות שונות נבדקו עבור עובר העופות המשנות את הלחץ התוך-קיראלי ואת לחץ הגזירה בקיר בפיתוח רכיבים קרדיווסקולריים. מודלים אלה כוללים קשירת ויטלין שמאלי, פס קונוטרונקל15 וקשירת פרוזדורים שמאלית (LAL) 11,12,16. הפנוטיפ שנוצר עקב העומס המכני שהשתנה ניתן לראות כ 24-48 שעות לאחר ההתערבות הכירורגית במחקרים המתמקדים בפרוגנוזה מוקדמת11,13. התערבות LAL היא טכניקה פופולרית לצמצום הנפח התפקודי של האטריום השמאלי (LA) על ידי הצבת לולאת תפר סביב הפתח האטריובנטריקולרי. כמו כן, בוצעו גם התערבויות מיקרוכירורגיות המכוונות לקשירת פרוזדורים ימנית (RAL) 17,18. באופן דומה, חלק מהחוקרים מכוונים לתוספתן פרוזדורים שמאלי (LAA) באמצעות מיקרוקליפים כדי להפחית את עוצמת הקול של LA19,20. במחקרים מסוימים, חוט ניילון כירורגי מוחל על הצומת אטריובנטריקולרי19,21. אחת ההתערבויות בהן נעשה שימוש היא LAL, אשר יכול לחקות HLHS אך הוא גם המודל הקשה ביותר לביצוע, עם תפוקת דגימות קטנה מאוד בשל הפעולות המיקרוכירורגיות העדינות ביותר הנדרשות. במעבדה שלנו, LAL מבוצע באובו בין שלבי המבורגר-המילטון (HH) 20 ו -21, לפני שהאטריום המשותף הוא מלא 6,14,22,23. תפר כירורגי ממוקם סביב לוס אנג’לס, אשר משנה את זרימת הדם intracardiac. במודלים LAL של HLHS, קשיחות מוגברת של דופן החדר, זוויות מיופייבר משתנות וגודל חלל LV מופחת נצפים14,24.
במאמר וידאו זה, פרוטוקול מפורט וגישה עבור in ovo LAL מסופק. בקצרה, עוברי העופות המופרים הודגרו לצורך מיקרו-כירורגיה, קליפת הביצה נסדקה והקרומים החיצוניים והפנימיים נוקו. לאחר מכן סובב את העובר באיטיות כך שלוס אנג’לס הייתה נגישה. תפר כירורגי מניילון 10-0 נקשר לניצן הפרוזדורים, והעובר הוחזר לכיוונו המקורי, תוך השלמת הליך LAL25. LAL וחדרים נורמליים מושווים עבור דחיסת רקמות ונפח החדר באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית והיסטולוגיה בסיסית.
צינור מודל LAL המבוצע בהצלחה, כמתואר כאן, יתרום למחקרים בסיסיים המתמקדים בהתפתחות העוברית של רכיבים קרדיווסקולריים. מודל זה יכול לשמש גם יחד עם מניפולציות גנטיות ושיטות הדמיה מתקדמות. כמו כן, מודל LAL חריף הוא מקור יציב של תאי כלי דם חולים לניסויים בתרביות רקמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב- HLHS, זרימת הדם משתנה עקב פגמים מבניים, מה שמוביל למורפולוגיה לא תקינה בצד שמאל 4,6. המודל הנוכחי מספק מערכת ניסויית מעשית כדי להבין טוב יותר את ההתקדמות של HLHS ואולי אפילו לחקות את הפתוגנזה שלו8. עם זאת, הקמת מודל בעלי חיים HLHS שווה ערך לחלוטין מבחי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בפרס החוקר הראשי של Tubitak 2247A 120C139 המספק מימון. המחברים רוצים גם להודות לפאקטבוק גידה. A. S., איסטנבול, טורקיה, על אספקת ביציות פוריות ותמיכה במחקר הלב וכלי הדם.
Materials
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D. HLHS: Power of the chick model. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (4), 113 (2022).
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
