Ligatie van het linker atrium in het vogelembryo als model voor veranderde hemodynamische belasting tijdens de vroege vasculaire ontwikkeling
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd visueel protocol voor het uitvoeren van het linker atriale ligatiemodel (LAL) in het vogelembryo. Het LAL-model verandert de intracardiale stroom, waardoor de belasting van de wandschuifspanning verandert, waardoor het hypoplastische linkerhartsyndroom wordt nagebootst. Er wordt een aanpak gepresenteerd om de uitdagingen van dit moeilijke microchirurgische model te overwinnen.
Abstract
Vanwege de volwassen ventriculaire configuratie met vier kamers, het gemak van kweek, toegang tot beeldvorming en efficiëntie, is het vogelembryo een geprefereerd diermodel voor gewervelde dieren voor het bestuderen van cardiovasculaire ontwikkeling. Studies die gericht zijn op het begrijpen van de normale ontwikkeling en de prognose van aangeboren hartafwijkingen maken op grote schaal gebruik van dit model. Microscopische chirurgische technieken worden geïntroduceerd om de normale mechanische belastingspatronen op een specifiek embryonaal tijdstip te veranderen en de stroomafwaartse moleculaire en genetische cascade te volgen. De meest voorkomende mechanische ingrepen zijn ligatie van de linker vitelline ader, conotruncale banding en ligatie van de linker atriale (LAL), waarbij de intramurale vasculaire druk en wandschuifspanning als gevolg van de bloedstroom worden gemoduleerd. LAL, vooral als het in ovo wordt uitgevoerd, is de meest uitdagende ingreep, met zeer kleine monsteropbrengsten als gevolg van de extreem fijne sequentiële microchirurgische ingrepen. Ondanks het hoge risico is in ovo LAL wetenschappelijk zeer waardevol omdat het de pathogenese van het hypoplastische linkerhartsyndroom (HLHS) nabootst. HLHS is een klinisch relevante, complexe aangeboren hartziekte die wordt waargenomen bij menselijke pasgeborenen. Een gedetailleerd protocol voor in ovo LAL is gedocumenteerd in dit document. In het kort werden bevruchte vogelembryo’s geïncubeerd bij 37,5 °C en een constante luchtvochtigheid van 60%, meestal totdat ze Hamburger-Hamilton (HH) stadia 20 tot 21 bereikten. De eierschalen werden opengebroken en de buiten- en binnenmembranen werden verwijderd. Het embryo werd voorzichtig gedraaid om de linker atriale bol van het gemeenschappelijke atrium bloot te leggen. Voorgemonteerde microknopen van 10-0 nylon hechtingen werden voorzichtig gepositioneerd en rond de linker boezemknop gebonden. Uiteindelijk werd het embryo teruggebracht naar zijn oorspronkelijke positie en werd LAL voltooid. Normale en LAL-geïnstrumenteerde ventrikels vertoonden statistisch significante verschillen in weefselverdichting. Een efficiënte pijplijn voor het genereren van LAL-modellen zou bijdragen aan studies die zich richten op gesynchroniseerde mechanische en genetische manipulatie tijdens de embryonale ontwikkeling van cardiovasculaire componenten. Evenzo zal dit model een verstoorde celbron bieden voor weefselkweekonderzoek en vasculaire biologie.
Introduction
Aangeboren hartafwijkingen (CHD’s) zijn structurele aandoeningen die optreden als gevolg van abnormale embryonale ontwikkeling1. Naast genetische aandoeningen wordt de pathogenese beïnvloed door veranderde mechanische belasting 2,3. Hypoplastisch linkerhartsyndroom (HLHS), een aangeboren hartafwijking, resulteert in een onderontwikkeld ventrikel/aorta bij de geboorte4 met een hoog sterftecijfer 5,6. Ondanks de recente vooruitgang in de klinische behandeling ervan, is de vasculaire groei en ontwikkelingsdynamiek van HLHS nog steeds onduidelijk7. Bij een normale embryonale ontwikkeling zijn het endocardium en het myocardium van de linker ventrikel (LV) afkomstig van cardiale voorlopercellen naarmate de vroege embryonale vorming van de hartbuis vordert. De geleidelijke aanwezigheid van myocardiale trabeculatie, verdikkende lagen en proliferatie van cardiomyocyten wordt gerapporteerd2. Voor HLHS worden veranderde trabeculaire remodellering en linkerventrikelafplatting waargenomen, wat verder bijdraagt aan myocardiale hypoplasie als gevolg van abnormale migratie van cardiomyocyten 2,8,9,10
Van de veelgebruikte modelorganismen om de ontwikkeling van het hart te bestuderen en hemodynamische omstandigheden te begrijpen 11, heeft het vogelembryo de voorkeur vanwege het volwassen hart met vier kamers en het gemak waarmee het kan worden gekweekt11,12,13,14. Aan de andere kant biedt geavanceerde beeldvormingstoegang van zebravisembryo’s en transgene/knock-out muizen duidelijke voordelen11,12. Er zijn verschillende mechanische ingrepen getest voor het vogelembryo die de intramurale druk en wandschuifspanning veranderen bij het ontwikkelen van cardiovasculaire componenten. Deze modellen omvatten ligatie van de linkervitelline, conotruncale banding15 en ligatie van het linker atrium (LAL)11,12,16. Het resulterende fenotype als gevolg van de veranderde mechanische belasting kan ongeveer 24-48 uur na de chirurgische ingreep worden waargenomen in onderzoeken die zich richten op vroege prognose11,13. De LAL-interventie is een populaire techniek om het functionele volume van het linker atrium (LA) te verkleinen door een hechtlus rond de atrioventriculaire opening te plaatsen. Evenzo zijn er ook microchirurgische ingrepen uitgevoerd die gericht zijn op het afbinden van het rechter atrium (RAL)17,18. Evenzo richten sommige onderzoekers zich op het linker hartoor (LAA) met behulp van microclips om het volume van de LA19,20 te verminderen. In sommige onderzoeken wordt een chirurgische nylondraad aangebracht op de atrioventriculaire knoop19,21. Een van de gebruikte interventies is LAL, dat HLHS kan nabootsen, maar ook het moeilijkste model is om uit te voeren, met zeer kleine monsteropbrengsten vanwege de extreem fijne microchirurgische ingrepen die nodig zijn. In ons laboratorium wordt LAL uitgevoerd in ovo tussen Hamburger-Hamilton (HH) stadia 20 en 21, voordat het gemeenschappelijke atrium volledig septaat 6,14,22,23 is. Rond de LA wordt een chirurgische hechting geplaatst, die de intracardiale bloedstroomstromen verandert. In LAL-modellen van HLHS worden verhoogde stijfheid van de ventrikelwand, veranderde myofiberhoeken en verminderde LV-holtegrootte waargenomen14,24.
In dit video-artikel wordt een gedetailleerd protocol en aanpak voor in ovo LAL gegeven. In het kort werden de bevruchte vogelembryo’s uitgebroed voor microchirurgie, werd de eierschaal opengebroken en werden de buiten- en binnenmembranen vrijgemaakt. Het embryo werd vervolgens langzaam gedraaid zodat de LA toegankelijk was. Een 10-0 nylon chirurgische hechting werd aan de atriale knop vastgemaakt en het embryo werd teruggebracht naar zijn oorspronkelijke oriëntatie, waarmee de LAL-procedure werd voltooid25. LAL en normale ventrikels worden vergeleken voor weefselverdichting en ventrikelvolume via optische coherentietomografie en basale histologie.
Een succesvol uitgevoerde LAL-modelpijplijn, zoals hier beschreven, zal bijdragen aan basisstudies die zich richten op de embryonale ontwikkeling van cardiovasculaire componenten. Dit model kan ook worden gebruikt in combinatie met genetische manipulaties en geavanceerde beeldvormingsmodaliteiten. Evenzo is het acute LAL-model een stabiele bron van zieke vasculaire cellen voor weefselkweekexperimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij HLHS is de bloedstroom veranderd als gevolg van structurele defecten, wat leidt tot abnormale morfologie aan de linkerkant 4,6. Het huidige model biedt een praktisch experimenteel systeem om de progressie van HLHS beter te begrijpen en kan zelfs de pathogenese ervan nabootsen8. Het opzetten van een volledig klinisch gelijkwaardig HLHS-diermodel is echter een uitdagende taak. Naast het hier gepresenteerde LAL-model voor vogels, hebben r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de Tubitak 2247A-prijs voor hoofdonderzoeker 120C139 voor het verstrekken van financiering. De auteurs willen ook PakTavuk Gıda bedanken. A. S., Istanbul, Turkije, voor het leveren van bevruchte eicellen en het ondersteunen van het cardiovasculaire onderzoek.
Materials
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D. HLHS: Power of the chick model. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (4), 113 (2022).
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
