Optogenetische remming van Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in combinatie met meting van epitheliale spanning in Drosophila-embryo's

Actomyosinecontractiliteit, de contractiele kracht die wordt uitgeoefend door niet-spiermyosine II (hierna ‘myosine’) op het F-actinenetwerk, is een van de belangrijkste krachten bij het veranderen van de celvorm en het aansturen van morfogenese^op weefselniveau ^1,2. De activering van actomyosinecontractiliteit op het apicale domein van de epitheelcellen resulteert bijvoorbeeld in apicale vernauwing, die een verscheidenheid aan morfogenetische processen vergemakkelijkt, waaronder epitheliale vouwing, celextrusie, delaminatie en wondgenezing 3,4,5,6,7 . De activering van myosine vereist fosforylering van de regulerende lichte keten. Deze modificatie verlicht de remmende conformatie van de myosinemoleculen, waardoor ze bipolaire myosinefilamentbundels kunnen vormen met meerdere hoofddomeinen aan beide uiteinden. De bipolaire myosinefilamenten drijven de anti-parallelle beweging van actinefilamenten aan en resulteren in het genereren van contractiele kracht ^1,8,9.

De evolutionair geconserveerde Rho-familie kleine GTPase RhoA (Rho1 in Drosophila) speelt een centrale rol in de activering van actomyosinecontractiliteit in verschillende cellulaire contexten^10,11. Rho1 functioneert als een bimoleculaire switch door gtp (actieve vorm) of bbp (inactieve vorm)^{12 te binden}. De cyclus tussen GTP- of GDP-gebonden Rho1 wordt gereguleerd door zijn GTPase-activerende eiwitten (GAPs) en guanine-nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF’s)¹³. GEF’s functioneren om de uitwisseling van BBP voor GTP te vergemakkelijken en zo Rho1-activiteit te activeren. GAPs daarentegen verbeteren de GTPase-activiteit van Rho1 en deactiveren zo Rho1. Geactiveerd Rho1 bevordert actomyosine contractiliteit door interactie met en activering van de downstream effectoren, Rho-geassocieerde kinase (Rok) en Diaphanous¹⁴. Rok induceert myosine-activering en actomyosinecontractiliteit door fosforylering van de regulerende lichte keten van myosine¹⁵. Daarnaast remt Rok ook de myosineregulerende lichte ketenfosfatase, en bevordert zo de myosinefilamentassemblage^{verder 16}. Rok kan ook LIM-kinasen fosforyleren, die, wanneer geactiveerd, actinedemontage voorkomen door de actine-depolymerisatiefactor cofiline^17,18 te fosforyleren en te remmen. Doorschijnend is een formine familie actine nucleator die actine polymerisatie bevordert, het verstrekken van een basis voor myosine te interageren met 19,20,21.

Hoewel de cellulaire mechanismen die actomyosinecontractiliteit activeren goed zijn opgehelderd, blijft ons begrip van de functie ervan bij het reguleren van dynamische weefselremodellering onvolledig. Het opvullen van deze kenniskloof vereist benaderingen die actomyosine snel kunnen inactiveren bij specifieke weefselregio’s in vivo en de onmiddellijke impact op weefselgedrag en -eigenschappen kunnen registreren. Dit protocol beschrijft het gebruik van een optogenetische benadering om actomyosinecontractiliteit acuut te remmen tijdens Drosophila mesoderm invaginatie, gevolgd door meting van epitheliale spanning met behulp van laserablatie. Tijdens Drosophila gastrulatie ondergaan de ventraal gelokaliseerde mesoderm-voorlopercellen apicale vernauwing en invaginaleren van het oppervlak van het embryo door een voorste-posterieur georiënteerde groef^{te vormen 22,23}. De vorming van ventrale groeven wordt al lang gebruikt als model voor het bestuderen van het mechanisme van epitheliale vouwing. Ventrale groefvorming wordt toegediend door het dorsaal-ventrale patroonsysteem in Drosophila^24,25,26,27. De expressie van twee transcriptiefactoren, Twist en Snail, gelegen aan de ventrale zijde van het embryo, regelt de ventrale groefvorming en specificeert het lot van mesodermale cellen²⁸. Twist en Snail activeren de rekrutering van de Rho1 GEF RhoGEF2 naar de top van de mesodermvoorlopercellen via een G-eiwit gekoppelde receptorroute en een RhoGEF2-adaptoreiwit, T48 29,30,31,32,33. Vervolgens activeert RhoGEF2 myosine in het apicale oppervlak van het potentiële mesoderm via de Rho-Rho-kinaseroute 34,35,36,37,38,39. Geactiveerd myosine vormt een supracellulair actomyosinenetwerk door het apicale oppervlak van het mesoderm primordium, waarvan de samentrekkingen apicale vernauwing veroorzaken en resulteren in een snelle toename van de apicale weefselspanning 14,37,40.

De optogenetische tool beschreven in dit protocol, Opto-Rho1DN, remt actomyosine contractiliteit door blauw-licht afhankelijke plasmamembraan rekrutering van een dominante negatieve vorm van Rho1 (Rho1DN)⁴¹. Een T19N-mutatie in Rho1DN elimineert het vermogen van het gemuteerde eiwit om GDP in te ruilen voor GTP en maakt het eiwit dus voortdurend inactief³⁴. Een volgende mutatie in Rho1DN, C189Y, elimineert het naïeve membraanrichtsignaal^42,43. Wanneer Rho1DN wordt toegediend aan het plasmamembraan, bindt het zich aan Rho1 GEF’s en neemt het het vast, waardoor de activering van Rho1 en Rho1-gemedieerde activering van myosine en actine^34,44 wordt geblokkeerd. De plasmamembraanrekrutering van Rho1DN wordt bereikt door een lichtafhankelijke dimerisatiemodule afgeleid van Cryptochrome 2 en zijn bindingspartner CIB1. Cryptochrome 2 is een blauwlicht geactiveerde Cryptochrome fotoreceptor in Arabidopsis thaliana⁴⁵. Cryptochroom 2 bindt aan CIB1, een basisch helix-loop-helix-eiwit, alleen in zijn foto-geëxciteerde toestand⁴⁵. Later bleek dat het geconserveerde N-terminale, fotolyase homologiegebied (PHR), van Cryptochrome 2 (CRY2_PHR, hierna CRY2 genoemd) en het N-terminale domein (aa 1-170) van CIB1 (hierna CIBN) belangrijk zijn voor lichtgeïnduceerde dimerisatie⁴⁶. Opto-Rho1DN bevat twee componenten. De eerste component is het CIBN-eiwit gefuseerd met een CAAX-anker, dat het eiwit lokaliseert naar het plasmamembraan⁴⁷. De tweede component is mCherry-tagged CRY2 gefuseerd met Rho1DN⁴¹. Bij afwezigheid van blauw licht blijft CRY2-Rho1DN in het cytoplasma. Bij stimulatie van blauw licht wordt CRY2-Rho1DN gericht op het plasmamembraan door de interactie tussen membraanverankerde CIBN en geëxciteerde CRY2. Opto-Rho1DN kan worden geactiveerd door ultraviolet A (UVA) licht en blauw licht (400-500 nm, piekactivering bij 450-488 nm), of door een 830-980 nm gepulseerde laser bij het uitvoeren van twee-foton stimulatie^41,46,47,48. Daarom wordt Opto-Rho1DN gestimuleerd door golflengten die normaal worden gebruikt voor opwindende GFP (488 nm voor beeldvorming met één foton en 920 nm voor beeldvorming met twee fotonen). Daarentegen stimuleren golflengten die gewoonlijk worden gebruikt voor opwindende mCherry (561 nm voor beeldvorming met één foton en 1.040 nm voor beeldvorming met twee fotonen) de optogenetische module niet en kunnen daarom worden gebruikt voor pre-stimulatiebeeldvorming. Het protocol beschrijft de benaderingen die worden gebruikt om het risico op ongewenste stimulatie tijdens monstermanipulatie te minimaliseren.

Laserablatie is op grote schaal gebruikt om spanning in cellen en weefsels te detecteren en te meten⁴⁹. Eerdere studies hebben aangetoond dat, wanneer de laserintensiteit op de juiste manier wordt gecontroleerd, twee-foton laserablatie met behulp van een femtoseconde nabij-infrarode laser sommige subcellulaire structuren (bijv. Corticale actomyosinenetwerken) fysiek kan aantasten zonder plasmamembraanopname^50,51 te veroorzaken. Als het weefsel onder spanning staat, resulteert laserablatie van een interessant gebied in het weefsel in een onmiddellijke uitwendige terugslag van de cellen naast het geableerde gebied. De terugslagsnelheid is een functie van de grootte van de spanning en de viscositeit van de media (cytoplasma) rond de structuren die terugslag ondergaan⁴⁹. Vanwege de superieure penetratiediepte van de nabij-infrarode lasers en het vermogen om goed begrensde focale ablatie te bereiken, is twee-foton laserablatie bijzonder nuttig voor het detecteren van weefselspanning in vivo. Zoals aangetoond in dit protocol, kan deze methode gemakkelijk worden gecombineerd met Opto-Rho1DN-gemedieerde inactivatie van actomyosinecontractiliteit om de directe impact van Rho1-afhankelijke cellulaire contractiliteit op weefselmechanica tijdens dynamische weefselremodellering te onderzoeken.