Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

La contractilidad de la actomiosina, la fuerza contráctil ejercida por la miosina II no muscular (en adelante, «miosina») sobre la red de actina F, es una de las fuerzas más importantes en el cambio de la forma celular y en la morfogénesis a nivel tisular ^1,2. Por ejemplo, la activación de la contractilidad de la actomiosina en el dominio apical de las células epiteliales da lugar a la constricción apical, lo que facilita una variedad de procesos morfogenéticos, incluido el plegamiento epitelial, la extrusión celular, la delaminación y la cicatrización de heridas 3,4,5,6,7 . La activación de la miosina requiere la fosforilación de su cadena ligera reguladora. Esta modificación alivia la conformación inhibitoria de las moléculas de miosina, permitiéndoles formar haces de filamentos de miosina bipolares con múltiples dominios de cabeza en ambos extremos. Los filamentos bipolares de miosina impulsan el movimiento antiparalelo de los filamentos de actina y dan lugar a la generación de fuerza contráctil ^1,8,9.

La pequeña GTPasa RhoA (Rho1 en Drosophila), conservada evolutivamente, desempeña un papel central en la activación de la contractilidad de la actomiosina en diversos contextos celulares^10,11. Rho1 funciona como un interruptor bimolecular al unirse a GTP (forma activa) o GDP (forma inactiva)¹². El ciclo entre Rho1 unido a GTP o GDP está regulado por sus proteínas activadoras de GTPasa (GAPs) y factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs)¹³. La función de los FMAM es facilitar el intercambio del PIB por el PIB y activar así la actividad de Rho1. Los GAPs, por otro lado, mejoran la actividad GTPasa de Rho1 y, por lo tanto, desactivan Rho1. La Rho1 activada promueve la contractilidad de la actomiosina a través de la interacción y la activación de sus efectores posteriores, la quinasa asociada a Rho (Rok) y la diáfana¹⁴. Rok induce la activación de la miosina y la contractilidad de la actomiosina mediante la fosforilación de la cadena ligera reguladora de la miosina¹⁵. Además, Rok también inhibe la fosfatasa de cadena ligera reguladora de la miosina y, por lo tanto, promueve aún más el ensamblaje del filamento de miosina¹⁶. Rok también puede fosforilar las quinasas LIM, que, cuando se activan, evitan el desensamblaje de la actina al fosforilar e inhibir el factor de despolimerización de actina cofilina^17,18. Diaphanous es un nucleador de actina de la familia de las forminas que promueve la polimerización de la actina, proporcionando una base para que la miosina interactúe con 19,20,21.

Si bien los mecanismos celulares que activan la contractilidad de la actomiosina han sido bien dilucidados, nuestra comprensión de su función en la regulación de la remodelación dinámica de los tejidos sigue siendo incompleta. Llenar este vacío de conocimiento requiere enfoques que puedan inactivar rápidamente la actomiosina en regiones específicas del tejido in vivo y registrar el impacto inmediato en el comportamiento y las propiedades de los tejidos. Este protocolo describe el uso de un enfoque optogenético para inhibir agudamente la contractilidad de la actomiosina durante la invaginación del mesodermo de Drosophila, seguida de la medición de la tensión epitelial mediante ablación láser. Durante la gastrulación de Drosophila, las células precursoras del mesodermo localizadas ventralmente sufren constricción apical y se invaginan desde la superficie del embrión formando un surco orientado antero-posterior^22,23. La formación de surcos ventrales se ha utilizado durante mucho tiempo como modelo para estudiar el mecanismo de plegamiento epitelial. La formación del surco ventral es administrada por el sistema de patrones dorsal-ventral en Drosophila^24,25,26,27. La expresión de dos factores de transcripción, Twist y Snail, localizados en el lado ventral del embrión, controla la formación del surco ventral y especifica el destino de las células mesodérmicas²⁸. Twist y Snail activan el reclutamiento de Rho1 GEF RhoGEF2 al ápice de las células precursoras del mesodermo a través de una vía receptora acoplada a proteína G y una proteína adaptadora RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. A continuación, RhoGEF2 activa la miosina en toda la superficie apical del mesodermo potencial a través de la vía de la quinasa Rho-Rho 34,35,36,37,38,39. La miosina activada forma una red supracelular de actomiosina a lo largo de la superficie apical del primordio del mesodermo, cuyas contracciones impulsan la constricción apical y dan lugar a un rápido aumento de la tensión del tejido apical 14,37,40.

La herramienta optogenética descrita en este protocolo, Opto-Rho1DN, inhibe la contractilidad de la actomiosina a través del reclutamiento en la membrana plasmática dependiente de la luz azul de una forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN)⁴¹. Una mutación T19N en Rho1DN elimina la capacidad de la proteína mutante para intercambiar GDP por GTP y, por lo tanto, hace que la proteína esté perpetuamente inactiva³⁴. Una mutación posterior en Rho1DN, C189Y, elimina su señal de direccionamiento de membrana ^42,43. Cuando Rho1DN se infunde en la membrana plasmática, se une a los GEF de Rho1 y los incauta, bloqueando así la activación de Rho1, así como la activación mediada por Rho1 de la miosina y la actina^34,44. El reclutamiento de Rho1DN en la membrana plasmática se logra a través de un módulo de dimerización dependiente de la luz derivado del criptocromo 2 y su socio de unión CIB1. El criptocromo 2 es un fotorreceptor criptocromo activado por luz azul en Arabidopsis thaliana⁴⁵. El criptocromo 2 se une a CIB1, una proteína básica de hélice-bucle-hélice, solo en su estado fotoexcitado⁴⁵. Más tarde se descubrió que la región de homología de fotoliasa (PHR) N-terminal conservada del criptocromo 2 (CRY2_PHR, en lo sucesivo denominado CRY2) y el dominio N-terminal (aa 1-170) de CIB1 (en adelante CIBN) son importantes para la dimerización inducida por la luz⁴⁶. Opto-Rho1DN contiene dos componentes. El primer componente es la proteína CIBN fusionada con un anclaje CAAX, que localiza la proteína en la membrana plasmática⁴⁷. El segundo componente es CRY2 marcado con mCherry fusionado con Rho1DN⁴¹. En ausencia de luz azul, CRY2-Rho1DN permanece en el citoplasma. Tras la estimulación con luz azul, CRY2-Rho1DN se dirige a la membrana plasmática a través de la interacción entre el CIBN anclado a la membrana y el CRY2 excitado. Opto-Rho1DN puede ser activado por luz ultravioleta A (UVA) y luz azul (400-500 nm, activación máxima a 450-488 nm), o por un láser pulsado de 830-980 nm cuando se realiza la estimulación de dos fotones^41,46,47,48. Por lo tanto, Opto-Rho1DN es estimulado por las longitudes de onda normalmente utilizadas para excitar la GFP (488 nm para imágenes de fotón único y 920 nm para imágenes de dos fotones). Por el contrario, las longitudes de onda comúnmente utilizadas para excitar mCherry (561 nm para imágenes de fotón único y 1.040 nm para imágenes de dos fotones) no estimulan el módulo optogenético y, por lo tanto, se pueden usar para imágenes de preestimulación. El protocolo describe los enfoques utilizados para minimizar el riesgo de estimulación no deseada durante la manipulación de la muestra.

La ablación con láser se ha empleado ampliamente para detectar y medir la tensión en células y tejidos⁴⁹. Estudios previos han demostrado que, cuando la intensidad del láser se controla adecuadamente, la ablación con láser de dos fotones que emplea un láser de infrarrojo cercano de femtosegundos puede dañar físicamente algunas estructuras subcelulares (por ejemplo, redes corticales de actomiosina) sin causar el éxtasis de la membrana plasmática^50,51. Si el tejido está bajo tensión, la ablación con láser de una región de interés dentro del tejido da como resultado un retroceso inmediato hacia afuera de las células adyacentes a la región ablacionada. La velocidad de retroceso es una función de la magnitud de la tensión y la viscosidad del medio (citoplasma) que rodea las estructuras que sufren retroceso⁴⁹. Debido a la profundidad de penetración superior de los láseres de infrarrojo cercano y la capacidad de lograr una ablación focal bien confinada, la ablación con láser de dos fotones es particularmente útil para detectar la tensión tisular in vivo. Como se demuestra en este protocolo, este método puede combinarse fácilmente con la inactivación mediada por Opto-Rho1DN de la contractilidad de la actomiosina para investigar el impacto directo de la contractilidad celular dependiente de Rho1 en la mecánica tisular durante la remodelación tisular dinámica.