ショウ ジョウバエ 胚におけるRho1を介したアクトミオシン収縮性の光遺伝学的阻害と上皮圧の測定

アクトミオシンの収縮性は、非筋ミオシンII(以下、ミオシン)がF-アクチンネットワークに及ぼす収縮力であり、細胞の形状を変化させ、組織レベルの形態形成を促進する上で最も重要な力の1つです^1,2。例えば、上皮細胞の頂端ドメインにおけるアクトミオシン収縮性の活性化は、頂端狭窄をもたらし、これは、上皮折り畳み、細胞押し出し、層間剥離、および創傷治癒を含む様々な形態形成プロセスを促進する3,4,5,6,7 .ミオシンの活性化は、その調節軽鎖のリン酸化を必要とする。この修飾は、ミオシン分子の阻害的立体配座を緩和し、それらが両端に複数のヘッドドメインを有する双極性ミオシンフィラメントバンドルを形成することを可能にする。バイポーラミオシンフィラメントは、アクチンフィラメントの反平行運動を駆動し、収縮力の生成をもたらします^1,8,9。

進化的に保存されたRhoファミリーの小型GTPase RhoA(ショウジョウバエのRho1)は、さまざまな細胞状況におけるアクトミオシン収縮性の活性化において中心的な役割を果たしています^10,11。Rho1は、GTP(活性型)またはGDP(不活性型)のいずれかに結合することにより、二分子スイッチとして機能します¹²。GTPまたはGDPに結合したRho1間の循環は、GTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)とグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)によって調節されています¹³。GEFは、GDPとGTPの交換を促進し、Rho1活性を活性化するように機能します。一方、GAPはRho1のGTPアーゼ活性を増強し、Rho1を不活性化します。活性化されたRho1は、その下流のエフェクターであるRho関連キナーゼ(Rok)およびDiaphanous¹⁴と相互作用して活性化することにより、アクトミオシンの収縮性を促進します。Rokは、ミオシン¹⁵の調節軽鎖をリン酸化することによりミオシン活性化およびアクトミオシン収縮性を誘導する。加えて、Rokはまた、ミオシン調節軽鎖ホスファターゼを阻害し、したがってミオシンフィラメント集合体をさらに促進する¹⁶。Rokはまた、LIMキナーゼをリン酸化することができ、活性化されると、アクチン解重合因子コフィリン^17,18をリン酸化および阻害することにより、アクチンの分解を防ぎます。Diaphaousは、アクチン重合を促進するホルミンファミリーアクチン核物質であり、ミオシンが19,20,21と相互作用するための塩基を提供します。

アクトミオシンの収縮性を活性化する細胞機構は十分に解明されていますが、動的組織リモデリングの制御におけるアクトミオシンの機能についての理解は未完了です。この知識のギャップを埋めるには、in vivoの特定の組織領域でアクトミオシンを迅速に不活性化し、組織の挙動と特性への即時の影響を記録できるアプローチが必要です。このプロトコルは、ショウジョウバエ中胚葉陥入中のアクトミオシン収縮性を急性に阻害するための光遺伝学的アプローチの使用と、それに続くレーザーアブレーションを使用した上皮張力の測定について説明しています。ショウジョウバエ原腸形成の間、腹側に局在する中胚葉前駆細胞は、前後向きの溝を形成することによって胚の表面から頂端狭窄を受け、陥入する^22,23。腹側の溝の形成は、上皮折り畳みのメカニズムを研究するためのモデルとして長い間使用されてきました。腹側溝形成は、ショウジョウバエ^24,25,26,27の背側-腹側パターンシステムによって管理されます。胚の腹側に位置する2つの転写因子、ツイストとカタツムリの発現は、腹側の溝の形成を制御し、中胚葉細胞の運命を特定します²⁸。ツイストとカタツムリは、Gタンパク質共役受容体経路とRhoGEF2アダプタータンパク質T48を介して、中胚葉前駆細胞の頂点へのRho1 GEF RhoGEF2の動員を活性化します^{T48 29,30,31,32,33}.次に、RhoGEF2は、Rho−Rhoキナーゼ経路^34、35、36、³⁷、³⁸、³⁹を介して^、潜在的な中胚葉の頂端表面全体にわたってミオシンを活性化する。活性化されたミオシンは、中胚葉原基の頂端表面全体に細胞上アクトミオシンネットワークを形成し、その収縮は頂端狭窄を引き起こし、頂端組織の張力の急速な増加をもたらす^14,37,40。

このプロトコルに記載されている光遺伝学的ツールであるOpto-Rho1DNは、優性陰性のRho1(Rho1DN)⁴¹の青色光依存性原形質膜動員を介してアクトミオシン収縮性を阻害します。Rho1DNのT19N変異は、変異タンパク質がGDPをGTPと交換する能力を排除し、したがってタンパク質を永久に不活性にします³⁴。その後のRho1DNの変異であるC189Yは、そのナイーブ膜ターゲティングシグナル^42,43を排除します。Rho1DNが原形質膜に注入されると、Rho1 GEFに結合して包囲し、それによってRho1の活性化とミオシンおよびアクチンのRho1を介した活性化をブロックします^34,44。Rho1DNの原形質膜動員は、クリプトクロム2とその結合パートナーであるCIB1に由来する光依存性二量体化モジュールによって達成されます。クリプトクロム2は、シロイヌナズナ⁴⁵の青色光活性化クリプトクロム光受容体である。クリプトクロム2は、光励起状態でのみ、塩基性らせん-ループ-らせんタンパク質であるCIB1に結合します⁴⁵。その後、クリプトクロム2(CRY2_PHR、以下CRY2と呼ぶ)とCIB1(以下CIBN)のN末端ドメイン(aa 1-170)から保存されたN末端フォトリアーゼ相同性領域(PHR)が光誘起二量体化に重要であることが判明した⁴⁶。Opto-Rho1DNには2つのコンポーネントが含まれています。第1の構成要素は、CAAXアンカーと融合したCIBNタンパク質であり、これは、タンパク質を原形質膜⁴⁷に局在化する。2番目のコンポーネントは、Rho1DN⁴¹と融合したmCherryタグ付きCRY2です。青色光がない場合、CRY2-Rho1DNは細胞質内に残ります。青色光刺激により、CRY2-Rho1DNは、膜固定CIBNと励起CRY2との間の相互作用を介して原形質膜に標的化される。Opto-Rho1DNは、紫外線A(UVA)光と青色光(400-500 nm、450-488 nmでのピーク活性化)、または2光子刺激を行う場合は830-980 nmパルスレーザーによって活性化することができます41,46,47,48。したがって、Opto-Rho1DNは、GFPの励起に通常使用される波長(単一光子イメージングでは488 nm、2光子イメージングでは920 nm)によって刺激されます。対照的に、mCherryの励起に一般的に使用される波長(単一光子イメージングの場合は561 nm、2光子イメージングの場合は1,040 nm)は、光遺伝学的モジュールを刺激しないため、刺激前のイメージングに使用できます。このプロトコルは、サンプル操作中の不要な刺激のリスクを最小限に抑えるために使用されるアプローチを説明しています。

レーザーアブレーションは、細胞および組織における張力を検出および測定するために広く用いられている⁴⁹。以前の研究では、レーザー強度が適切に制御されている場合、フェムト秒近赤外レーザーを用いた2光子レーザーアブレーションは、原形質膜の歓喜を引き起こすことなく、いくつかの細胞内構造(例えば、皮質アクトミオシンネットワーク)を物理的に損なう可能性があることが示されています^50,51。組織が張力下にある場合、組織内の関心領域のレーザーアブレーションは、切除領域に隣接する細胞の即時外向きの反動をもたらす。反跳速度は、反跳⁴⁹を受ける構造を取り囲む媒体(細胞質)の張力および粘度の大きさの関数である。近赤外レーザーの優れた浸透深さと十分に閉じ込められた焦点アブレーションを達成する能力のために、二光子レーザーアブレーションはin vivoでの組織張力を検出するのに特に有用です。このプロトコルで実証されているように、この方法は、Opto-Rho1DNを介したアクトミオシン収縮性の不活性化と簡単に組み合わせて、動的組織リモデリング中の組織力学に対するRho1依存性細胞収縮性の直接的な影響を調べることができます。