JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Drosophila melanogaster kullanarak uçucu ajanların yüksek verimli araştırılması için seri anestezi dizisi

Published: February 24, 2023
doi:
10.3791/65144
, , ,
1Department of Anesthesiology,University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medical Genetics,University of Wisconsin-Madison

Summary

Meyve sineği (Drosophila melanogaster) biyolojik ve toksikolojik araştırmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Sineklerin faydasını genişletmek için, aynı anda birden fazla sinek örneğini uçucu genel anesteziklere (VGA’lar) maruz bırakan ve VGA’ların yan etkilerini (toksik ve koruyucu) araştırmayı mümkün kılan seri anestezi dizisi adlı bir cihaz geliştirdik.

Abstract

Uçucu genel anestezikler (VGA’lar) dünya çapında her yaştan ve tıbbi durumdan milyonlarca insan üzerinde kullanılmaktadır. Yüksek konsantrasyonlarda VGA’lar (yüzlerce mikromolar ila düşük milimolar), gözlemciye “anestezi” olarak sunulan beyin fonksiyonunun derin ve fizyolojik olmayan bir baskılanmasını sağlamak için gereklidir. Bu kadar yüksek konsantrasyonlarda lipofilik ajanların tetiklediği kollateral etkilerin tam spektrumu bilinmemektedir, ancak biyolojik önemi anlaşılmamasına rağmen, immün-enflamatuar sistem ile etkileşimler kaydedilmiştir.

VGA’ların hayvanlardaki biyolojik etkilerini araştırmak için, meyve sineğinin (Drosophila melanogaster) sunduğu deneysel avantajlardan yararlanmak için seri anestezi dizisi (SAA) adı verilen bir sistem geliştirdik. SAA, seri olarak düzenlenmiş ve ortak bir girişe bağlı sekiz odadan oluşur. Bazı parçalar laboratuvarda mevcuttur ve diğerleri kolayca üretilebilir veya satın alınabilir. VGA’ların kalibre edilmiş uygulaması için gerekli olan bir buharlaştırıcı, ticari olarak üretilen tek bileşendir. VGA’lar, çalışma sırasında SAA’dan akan atmosferin sadece küçük bir yüzdesini oluşturur, çünkü kütle (tipik olarak% 95’in üzerinde) taşıyıcı gazdır; Varsayılan taşıyıcı Hava’dır. Bununla birlikte, oksijen ve diğer gazlar araştırılabilir.

SAA’nın önceki sistemlere göre başlıca avantajı, birden fazla sinek kohortunun, tam olarak titredilebilir VGA dozlarına aynı anda maruz kalmasına izin vermesidir. Tüm odalarda dakikalar içinde aynı VGA konsantrasyonları elde edilir, böylece ayırt edilemez deneysel koşullar sağlanır. Her oda tek bir sinekten yüzlerce sineğe kadar içerebilir. Örneğin, SAA aynı anda sekiz farklı genotipi veya farklı biyolojik değişkenlere sahip dört genotipi (örneğin, erkek ve kadın, yaşlı ve genç) inceleyebilir. SAA’yı, VGA’ların farmakodinamiklerini ve farmakogenetik etkileşimlerini, nöroinflamasyon-mitokondriyal mutantlar ve travmatik beyin hasarı (TBI) ile ilişkili iki deneysel sinek modelinde araştırmak için kullandık.

Introduction

Kollateral anestezik etkilerin varlığı (yani, hemen gözlenemeyen ancak davranışsal sonuçları geciktirebilecek etkiler) genel olarak kabul edilir, ancak mekanizmalarının ve risk faktörlerinin anlaşılması ilkel kalır 1,2. Gecikmiş tezahürleri ve incelikleri, memeli modellerinde makul zaman dilimlerinde ve kabul edilebilir bir maliyetle araştırılabilecek potansiyel olarak önemli değişkenlerin sayısını sınırlar. Meyve sineği (Drosophila melanogaster), nörodejeneratif hastalık3 bağlamında ve toksikolojik tarama4 için, bugüne kadar anestezik yan etkilerin incelenmesine uygulanmamış benzersiz avantajlar sunmaktadır.

Anestezik farmakodinamik ve farmakogenetik çalışmalarında meyve sineklerinin kullanımını kolaylaştırmak için seri anestezi dizisini (SAA) geliştirdik. SAA’nın önemli bir avantajı, birden fazla kohortun aynı deneysel koşullarına aynı anda maruz kalmasıdır. Meyve sineklerinin deneysel esnekliği ile eşleştirildiğinde, SAA’nın yüksek verimi, memeli modellerinde imkansız bir ölçekte biyolojik ve çevresel değişkenlerin araştırılmasına izin verir.

Prensip olarak, SAA basitçe bir taşıyıcı gazın uçucu maddeler sağladığı bir dizi bağlı anestezi yeridir (50 mL şişelerden yapılmış odalar). Sistemin ilk odası, taşıyıcı gazın nemlendirildiği damıtılmış su içerir (sinekler dehidrasyona duyarlıdır) ve sistemdeki gaz akışını gösteren basit bir akış göstergesi ile sona erer. Bağlantı borusunun açıklıklarına yerleştirilen ince ağlar, sineklerin odalar arasında göçünü önlemek için odaları ayırır. “Seri halinde” konumların sayısı, basınçsız gaz akışına (boru, ağlar) karşı direnç ile sınırlıdır.

Bu SAA prototipinin kinetiğini, önceki bir yayın5’te karakterize ettik. Kesin farmakokinetik özellikler SAA’lar arasında değişmekle birlikte, deneysel olarak test edilen ilgili temeller aşağıdaki gibidir: (i) 1.5-2 L / dak’lık bir başlangıç akışı, tüm odaları (toplam hacim ±550 mL) 2 dakika içinde istenen anestezik konsantrasyonu ile dengeler; (ii) Odalara verilen anestezik buharın konsantrasyonu, ilk ve son konum arasında kayda değer bir şekilde değişmez, çünkü tek bir odadaki gaz hacminde (50 mL) bulunan anestezik miktarı, herhangi bir sayıda sinek tarafından alınan miktardan çok daha fazladır; ve (iii) odalar dengelendikten sonra, çevrenin israfını ve kirlenmesini önlemek için taşıyıcı gaz akışı azaltılabilir (50-100 mL / dak veya daha az) (uçucu anestezikler sera gazı özelliklerine sahiptir). Kararlı halde bir buhar konsantrasyonunu korumak için gerekli olan minimum akış, öncelikle SAA’nın sızıntısına bağlıdır, çünkü sinekler tarafından buhar alımı ihmal edilebilir. Bu standart koşullar altında (% 2 izofluran ve 1.5 L / dak taşıyıcı gaz akışı), sinekler 3-4 dakika içinde dizinin tüm konumlarında, pozisyonlar arasında fark edilmeyen farklılıklarla uyuşturulur (yani hareketsiz). VGA’lar dakikalar ila saatler arasında uygulanabilir ve tipik maruz kalma paradigmalarımız 15 dakika ila 2 saat arasındadır. Sistemi yıkamak için buharlaştırıcı kapatılır ve dizinin yaklaşık 10 katı hacmini (5 dakika boyunca 1,5 L/dak) değiştirmek için akış korunur. Anestezik eliminasyonun hızı, ayarlanan akış hızına göre değişecektir.

Uçucu anestezik ajanlar, immün-inflamatuar sistem6 da dahil olmak üzere hala tanımlanamayan çok sayıda hedefle etkileşime girer. Bireysel moleküler hedeflerin primer ve kollateral sonuçlara katkısı (“anestezik durum” ve uzun ve kısa vadeli “yan etkiler”) tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, hassas, yüksek verimli bir sinek sistemi, sinekler ve memeliler arasındaki bariz farklılıklara rağmen, daha yüksek hayvanlardaki deneyleri bilgilendirmek için değerlidir7. Bazı farklılıklar aslında avantajlı olabilir; Örneğin, sineğin bağışıklık sistemi, yanıt8’in uyarlanabilir kolundan yoksun olması nedeniyle daha yüksek hayvanlarınkinden farklıdır. Bu, insanlarda hastalığı anlamak için bir sınırlama gibi görünse de, VGA’ların doğuştan gelen immün-enflamatuar yanıtla etkileşimini, adaptif yanıttan izole olarak incelemek için eşsiz bir fırsat sunar9. Bu, VGA’nın inflamasyon üzerindeki farmakolojik etkilerinin ve bunların bir popülasyonda bulunan çeşitli genetik geçmişlerle modülasyonunun incelenmesine izin verir.

Protocol

NOT: Protokolde kullanılan tüm malzemeler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız. 1. SAA’nın inşası Ahşabı keserek ve çerçeveyi Şekil 1A’daki boyutları kullanarak monte ederek çerçeveyi yapın. 50 mL konik tüp kapaklarını değiştirin.Her kapakta 9/32 matkap ucu ile iki delik açın. Düzensiz plastiği temizlemek için delikleri zımparalayın. Yüzeyi pürüzlendirmek için kapağın üstünü zımparalayın (bu, tutkalın yapışmasına yardımcı olur). 5 mL serolojik pipetleri, plastiği puanlayarak ve ardından puanlanan çizgide temizleyerek boyutlarına göre kesin (giriş için 3 inç ve çıkış için 1,5 inç). Kesilen/kırılan pipetlerin uçlarını zımparalayın. Tüplere tutkal ağı (yapıştırıcı için uygun kuruma süresine izin verin). Yapıştırıcı kuruduktan sonra ağı tüpün boyutuna kadar kesin. Tüpleri, her iki tüp de kapağın üzerinde (3/4 inç) uzanacak şekilde konik kapakların deliklerine yerleştirin; Giriş tüpünün tüpün içine çıkıştan daha uzun süre uzadığından emin olun (Şekil 1B). Parçaları birbirine sabitlemek için tüplerin etrafındaki kapakların üst kısımlarına yapıştırıcı uygulayın (devam etmeden önce yapıştırıcı için uygun kuruma süresine izin verin). Kapakları çerçeveye takın ve boruyu yönlendirin (Şekil 1C).Yapışkan kablo bağlarını çerçeveye takın (3,25 aralıklı, merkezden merkeze). Fermuarlı bağları kullanarak kapakları çerçeveye yapıştırın; Fermuar kravat etiketini kısa kesin. Tygon borusunun uzunluklarını (9 inç) kesin ve her modifiye kapaktaki giriş/çıkış borularına bağlayın (Şekil 1D). Yukarı akış ucundan başlayarak, önce girişe takın ve daha sonra boruyu çıkıştan bir sonraki konumun girişine takın. En aşağı akış “girişine” bir akış göstergesi ekleyin (konum 10, Şekil 1E). İlk pozisyona 50 mL’lik bir konik tüp koyun ve giriş tüpünün hemen altına suyla doldurun (Şekil 1F). Buharlaştırıcı için ara yüzeyi hazırlayın. Pistonları çıkarın, iki adet 10 mL dağıtım şırıngasından çentikleri kesin (1/2 inç derin x 1/4 genişlikte, Şekil 1G) ve bunları buharlaştırıcı girişine ve çıkışına, deliklerle hizalanmak üzere çentikler doğrudan buharlaştırıcının önüne bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 1H). İsteğe bağlı: Modifiye edilmiş şırıngaları yerine yapıştırın. Uygun fiyatlıysa, ticari bir manifold kullanın (bir seçenek için Malzeme Tablosuna bakın). Tüm sistemi bağlayın. Bileşenleri aşağıdaki sırayla birbirine bağlamak için Tygon borusunu kullanın: regülatörlü taşıyıcı gaz tankı > gaza özgü debimetre > buharlaştırıcı > SAA (Şekil 1C). Dizideki boş konumları boş 50 mL konik tüplerle doldurun. Gaz tankını açın, debimetreyi ~ 2 L / dak’ya açın ve buharlaştırıcıyı% 0’a kadar açın. Akış için buharlaştırıcının akış yönündeki debimetreyi ve SAA’nın son odasının çıkış yönündeki akış göstergesini kontrol ederek sistemdeki gaz akışını onaylayın. Alternatif olarak, aşağı akış boru ucunu suya yerleştirin ve kabarcıkları arayın.NOT: Sistem basınçlandırılmadığından, birkaç santimetreden daha yüksek bir su sütunu akışı durduracaktır. Dizinin aşağı akış ucunda akış yoksa, aşağıdakileri kontrol edin: akışa izin vermek için buharlaştırıcının açık olması gerekir; tank regülatörünün ve debimetrelerin akışa izin verip vermediğini kontrol edin; tüplerin sıkıca vidalandığından emin olmak için dizi konumlarını kontrol edin; ve modifiye kapaklardaki yapıştırıcının etrafındaki sızıntıları kontrol edin. Şekil 1: SAA’nın inşası . (A) SAA’yı destekleyen ahşap çerçevenin ölçümleriyle birlikte şeması. (B) 5 mL serolojik pipetlerden yapılmış giriş ve çıkış tüplerine sahip modifiye edilmiş bir kapağın ölçümleriyle şematize edilmiş kesiti. (C) Montajlı SAA (Olufs et al.5’ten çoğaltılmıştır) (D) Giriş ve çıkış tüplerini gösteren modifiye edilmiş 50 mL konik kapağın ayrıntıları. (E) Akış göstergesi ile aşağı akış (konum 10) çıkışı. (F) Taşıyıcı gazı nemlendirmek için yukarı akış (konum 1) su dolu tüp. Kırmızı ok su seviyesini gösterir. (G) Derme çatma manifold için modifiye edilmiş 10 mL dağıtım şırıngası. Kırmızı daire, 8 mL ile 10 mL işaretleri (veya 1/2 inç x 1/4 inç) arasında bulunan kesme çentiğini vurgular. (H) Modifiye şırıngaların takılmasını ve yönlendirilmesini gösteren Tec7 buharlaştırıcının arkadan görünümü. Bu görünümde, solda, modifiye edilmiş şırınganın çentiği ile hizalanması gereken deliği (kırmızı ok) göstermek için sadece bir şırınga bulunmaktadır. Not: Bu kesme çentiğinin yanlış hizalanması ve çıkış açıklığı anestezik uygulamayı bozacaktır. Bu kısım, bu ısmarlama sistemde potansiyel bir zayıf noktadır. Fonlar mevcutsa, ticari bir manifold kullanılmalıdır. Kısaltma: SAA = seri anestezi dizisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. 2. Anestezik maruziyetten önce Anestezik maruziyetten yirmi dört saat veya daha uzun bir süre önce, tercih edilen yöntemi (örneğin, CO2 veya eter) kullanarak sinek kohortlarını deney için gerektiği gibi sıralayın. 3. SAO’nun İşleyişi Sinekleri yiyecek şişelerinden boş 50 mL konik tüplere (CO2 olmadan) aktarın.Maruz kalmadan önce ölü sinekleri sayın ve kaydedin. 50 mL’lik konik tüplerin kapağını sökün ve sineklerle SAA’ya vidalayın. Taşıyıcı gazı açın ve istenen akış hızına ayarlayın.NOT: Genellikle 1-2 L/dak kullanırız. Anestezik buharlaştırıcıyı istenen konsantrasyona ayarlayın.NOT: Tipik olarak, memelilerde eşit güçlü dozlar olan izofluran için% 2 ve sevofluran için% 3.5 kullanıyoruz10. Sinekleri istenen süre boyunca (min: 15 dk.) maruz bırakın.NOT: SAA’nın pozisyonları arasında dengede olası değişkenliği önlemek için minimum 15 dakikalık bir maruz kalma süresi önerilir. Bu sistemde, anesteziklerin tüm pozisyonlarda dengelenmesi 2-3 dakika sürer. Maruz kalmanın sonunda, sistemi, toplam SAA hacminin yaklaşık 10x hacmine karşılık gelen 5 dakika boyunca 1,5 L/dak’da taze gaz akışıyla (buharlaştırıcı% 0’a ayarlanmış) yıkayın. 4. Bir denemeye başlamadan önce kontrol listesi Yüksek basınç regülatörünü (hava tankının üstündeki) tamamen açın ve ardından taşıyıcı gaz akışını sağlamak için yarım tur kapatın. Her hat için boruları i) debimetrelere ve ii) buharlaştırıcıya (giriş / çıkışın doğru şekilde bağlandığından emin olun) takip edin ve iii) buharlaştırıcılardaki anestezik seviyeyi kontrol edin. Odaları deneklerle doldurduktan sonra, kabarcık testi veya akış göstergesi ile havanın/gazın akıp akmadığını kontrol edin.NOT: Bazı buharlaştırıcılar, kadran kapalı konumdayken hava akışına izin vermez. Gaz akarken, hem debimetrenin hem de aşağı akış akış göstergesinin akışı gösterdiğini doğrulayın. Deneyin sonunda, anesteziyi yıkamak için 4-5 dakika hava akışına izin verin.

Representative Results

Burada bir SAA video bağlantısı verilmiştir: Perouansky Araştırma Yöntemleri – Anesteziyoloji Bölümü – UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Laboratuvarımız SAA’yı (i) genotipin anesteziklere davranışsal duyarlılık üzerindeki etkisini incelemek için kullanmıştır5; (ii) mitokondriyal mutantları anesteziklerin kollateral etkileri açısından tarar11; ve (iii) izofluran ve sevofluranın farmakodinamiğini travmatik beyin hasarı (TBI)12,13,14,15,16,17 sonuçları üzerinde araştırmak. Yayınlanan sonuçlar, genetik arka planın klinik olarak kullanılan VGA’ların farmakodinamiklerini hem konvansiyonel anestezi fenotipi hem de anestezik toksisitenin kollateral etkileri ve doku koruması açısından etkilediğini açıkça göstermektedir 5,11,13,14,15. Temsili örnek 1 (Şekil 2): Güvenilir şekilde tekrarlanabilir deney koşulları tarafından tespit edilen izofluran toksisitesine karşı esneklikte genetik sürüklenmeAyrı ayrı kültürlenmiş ND2360114 sinekleri arasında VGA’ya bağlı mortalitede kademeli bir kantitatif değişimin keşfi, SAA’yı kullanan deney grupları arasında anestezik farmakodinamiğin güvenilir karşılaştırmalarının yararlılığının bir örneğidir. ND23 , mETC’nin Kompleks I’inin çekirdeğindeki bir alt birimi kodlayan bir gendir (memelilerde Ndufs8’e benzer)18. Bu alt birimdeki mutasyonlar, ölümcül bir mitokondriyal hastalık olan Leigh sendromunun bir nedenidir. Standart laboratuvar koşulları altında (yani VGA’lara maruz kalmadan) aynı anda kültürlenen çeşitli homozigot ND2360114 stoklarında izofluran kaynaklı mortalite fenotipinin zaman içinde kademeli olarak zayıfladığını gözlemledik. İzofluran toksisitesine bu evrimsel adaptasyon, VGA’lara herhangi bir maruz kalmanın yokluğunda meydana geldi ve muhtemelen mutant stoklarda “en uygun olanın hayatta kalmasının” bir yan etkisidir. İzofluran duyarlılığındaki bu kademeli değişim, deneysel koşulların tahliller boyunca ve zaman içinde aynı olduğuna dair güvenimiz olmadan tanınmadan kalırdı. Seçilimin, ND2360114’ün etkilerinin değiştiricilerini desteklediği, izofluran toksisitesine karşı tesadüfen artan direnç gösterdiği sonucuna vardık. Merkezi sinir sistemindeki inflamasyon Leigh sendromunun patogenezinde önemli bir rol oynadığından, direncin tanık olduğu evrim, doğuştan gelen immün-enflamatuar yanıttaki adaptif değişikliklere bağlı olabilir ve izofluran toksisitesine direnç tesadüfi bir yan üründür. Şekil 2: ND2360114 sineklerindeki evrimsel basıncın bir sonucu olarak izofluran toksisitesine bağlı mortalitedeki değişim. Tek bir popülasyondan tek çiftli çiftleşmeler yoluyla izole edilen, genişletilmiş ve %2 izofluran’a (10-13 günlükken) 2 saatlik bir maruziyetten sonra 24 saat mortalite (PM24) için test edilen yedi çizgi (A-G), tek bir popülasyondan kaynaklanan fenotipte değişkenlik göstermektedir. Kutu ve bıyık grafikleri olarak gösterilen veriler. Kutular, verilerin ikinci ve üçüncü çeyreklerini temsil eder ve bıyıklar minimum ve maksimum veri noktalarına kadar uzanır. Ortalama ve medyan sırasıyla “+” ve yatay çizgilerle gösterilir. Bireysel replikaların (N) ölüm yüzdesi daireler halinde gösterilir. N = 20-50 sinek/şişeden oluşan 3-4 şişe. Sıradan bir tek yönlü ANOVA için P-değeri; p = 0.012, ortalamalar arasında anlamlı bir fark olduğunu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Temsili örnek 2 (Şekil 3): İzofluran farmakodinamiği üzerindeki genetik arka plan etkilerini ortaya çıkarmak için SAA’nın yüksek verimli bir uygulamasının gösterimiSistemin yüksek verimine bir örnek olarak, Şekil 3, travmatik beyin hasarından (TBI) önce izofluran’a (% 2 izofluran’ın 15 dakikası) aynı maruziyetlerin etkilerini göstermektedir 16, bu sinek modelinde anestezik ön koşullandırmayı (AP) test eden bir protokol13,15,19. Okuma, TBH’nin doğal yıpranma için düzeltilmesinden 24 saat sonra mortalitedir (MI24). Bu modelde, tüm sinekler TBI’dan sonraki 30 dakika içinde hareketliliği yeniden kazandılar (yani hayattaydılar) ve MI24’te kaydedilen ölüm oranı ikincil beyin hasarının (sBI) bir sonucuydu. Dört sinek hattında, izofluran içeren AP, MI24’ü çeşitli derecelere indirgedi, bu da AP’ye tepkinin nicel bir özellik olduğunu gösterdi. İnflamatuar yanıt sBI’dan kaynaklanan morbiditede önemli bir faktör olduğundan, AP immün sistemin modülasyonunu içerebilir20. Şekil 3: İzofluran ile ön koşullandırma ile mortalitenin baskılanması (MI24) üzerine genetik arka planın etkisi. 15 dakikalık% 2 izofluran (mor) içeren ön koşullandırma sinekleri, w 1118 ve y1w1118 suşlarında 24 saatte (MI24) mortalite indeksini azaltmıştır (sırasıyla p < 0.0001 ve p = 0.036). MI24, önceden koşullandırılmış Oregon R (OR) ve Kanton S (CS) hatlarında anlamlı derecede düşük değildi (sırasıyla p = 0.16 ve p = 0.27). Kutu ve bıyık grafikleri olarak gösterilen veriler. Kutular, verilerin ikinci ve üçüncü çeyreklerini temsil eder ve bıyıklar minimum ve maksimum veri noktalarına kadar uzanır. Ortalama ve medyan sırasıyla “+” ve yatay çizgilerle gösterilir. Tek tek çoğaltmaların MI24 değerleri (N) daireler halinde gösterilir. N = TBI ile muamele edilmiş sinekler için 30-40 sinek / flakondan oluşan 15-33 şişe. N = İşlenmemiş kontroller için 30-40 sinek/flakondan oluşan 2-15 şişe. Eşleşmemiş, iki kuyruklu bir Student’s t-testinden P-değerleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

SAA’nın yapımındaki kritik adımlar, anestezik gaz karışımının sızmasını önlemek için sıkı bağlantı parçalarının sağlanmasını içerir. SAA, laboratuvar alanının kirlenmesini önlemek için bir duman davlumbazına yerleştirilmelidir. Taşıyıcı gaz tüplerinden SAA’nın çıkış yönündeki akış göstergesine kadar tüm elemanlar, kontrol listesinde belirtildiği gibi kontrol edilmelidir.

VGA’ları sineklere uygulamanın diğer yöntemlerinin çalıştırılması karmaşıktır (inebriometre)21, düşük verime sahiptir22, birden fazla popülasyonun aynı anda maruz kalmasına izin vermez 23, anestezik konsantrasyonun kesin kontrolüne izin vermez 21 veya klinik olarak kabul edilen terimlere çevrilmesi zor bir okuma24.

SAA’nın mevcut versiyonu ticari bir buharlaştırıcıya dayanmaktadır ve bu nedenle toksikolojik çalışmalar uçucu anesteziklerle sınırlıdır. Diğer uçucu maddelerle birlikte kullanılırsa, çıktıyı kalibre ettikten sonra bir buharlaştırıcı “etiket dışı” kullanılabilir. Alternatif olarak, uçucu maddeleri buharlaştırmak için farklı bir yöntem uygulanabilir, bu da daha önce açıklandığı gibi ilaç konsantrasyonlarını titre etmek için özel ölçümler gerektirir25.

Akış göstergeleri dışında, alarm yoktur (yani, tanklar boşalırsa, SAA’dan geçen akış kesintiye uğrayacaktır). Kullanımın yoğunluğuna bağlı olarak, SAA’nın Tygon borusunun temizlenmesi, sıkılması ve muhtemelen değiştirilmesi gerekebilir. Orijinal SAA’mızda 7 yıllık kullanımda iki kez “bakım” yaptık.

Meyve sineklerini uyuşturmak için kullanılan bu yöntem, Drosophila araştırmacılarına sunulan genetik araç kutusunun yüksek verimli bir sistemde kullanılmasına izin verir. Farklı popülasyonlardaki sineklerin çoklu kohortları (örneğin, genotip, yaş, cinsiyet) aynı anda aynı anestezik konsantrasyonlara ve eldeki araştırma sorusuna uygun istenen taşıyıcı gaz kombinasyonuna (hava, O 2, N2 O, soy gazlar) maruz bırakılabilir.

Burada, SAA’nın ND2360114 sinek hattındaki izofluran toksisitesine karşı esneklikte beklenmedik değişiklikleri ortaya çıkarmak için yararlı olduğunu ve standart laboratuvar sinek hatlarının AP’ye tepkilerinde farklılık gösterdiğini gösteriyoruz.

SAA, diğer uçucu organik bileşiklerin (VOC’ler) böcekler (örneğin, bal arıları) üzerindeki etkilerini incelemek için uyarlanabilir. Buhar basınçları uçucu anesteziklerinkine yakın olan VOC’ler için (izofluran: 20 ° C’de 240 mmHg), geleneksel buharlaştırıcılar kullanılabilir, ancak çıkışın kalibre edilmesi gerekir. Desfluran için ticari buharlaştırıcı ısıtılır ve potansiyel olarak ek esneklik sunar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SAA prototipinin yapımı için Wisconsin-Madison Üniversitesi Pearce Laboratuvarı, Anesteziyoloji Bölümü Mark G. Perkins’e teşekkür ederiz. Çalışma, R01GM134107 ile Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Anesteziyoloji Bölümü Ar-Ge fonu tarafından desteklenmektedir.

Materials

Serial Anesthesia Array: 
5 mL Serological Pipettes Fisher Scientific 13-676-10C Polystyrene, 5mL serological pipette
50 mL Conical Tubes Fisher Scientific 1495949A Polypropylene, 50 mL
Cable Tie Mounting Pad Grainger 6EEE6 1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H
Dispensing Syringe Grainger 5FVE0 10 mL with Luer-Lock Connection
Fabric Mesh Netting 1 mm mesh
Flow Indicator Grainger 8RH52 5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style
Tygon Tubing Tygon E-3603 ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16
Wood Frame 10 feet of 2 inch x 3/4 inch
Zip Tie >5inch
Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold):
Dispensing Syringe Grainger 5FVE0 10 mL with Luer-Lock Connection
Commercial Manifold and Vaporizers:
1/4 inch Equal Barbed Y Connector Somni Scientific BF-9000
1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic) Somni Scientific BF-9004
AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob Somni Scientific FP-4002
Flowmeter auxiliary mounting bracket Somni Scientific NonInvPart
Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male Somni Scientific GF-11012
TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included) Somni Scientific TT-17000
Tec 7 Isoflurane Vaporizer GE Datex-Ohmeda 1175-9101-000 Agent-specific vaporizer (Isoflurane)
Tec 7 Sevoflurane Vaporizer GE Datex-Ohmeda 1175-9301-000 Agent-specific vaporizer (Sevoflurane)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jevtovic-Todorovic, V., et al. Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits. The Journal of Neuroscience. 23 (3), 876-882 (2003).
  2. Vutskits, L., Xie, Z. Lasting impact of general anaesthesia on the brain: Mechanisms and relevance. Nature Reviews Neuroscience. 17 (11), 705-717 (2016).
  3. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  4. Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
  5. Olufs, Z. P. G., Loewen, C. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Genetic variability affects absolute and relative potencies and kinetics of the anesthetics isoflurane and sevoflurane in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 8, 2348 (2018).
  6. Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
  7. Yamaguchi, M., Yoshida, H. . Drosophila as a model organism. In Drosophila Models for Human Diseases., edited by. , 1-10 (2018).
  8. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
  9. Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster-From microbial recognition to whole-organism physiology. Nature Reviews Immunology. 14 (12), 796-810 (2014).
  10. Shaughnessy, M. R., Hofmeister, E. H. A systematic review of sevoflurane and isoflurane minimum alveolar concentration in domestic cats. Veterinary Anaesthesia and Analgesia. 41 (1), 1-13 (2014).
  11. Olufs, Z. P. G., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Mitochondrial complex I mutations predispose Drosophila to isoflurane neurotoxicity. Anesthesiology. 133 (4), 839-851 (2020).
  12. Johnson-Schlitz, D., et al. Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).
  13. Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Lasarev, M. R., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Ageing and genetic background influence anaesthetic effects in a D. melanogaster model of blunt trauma with brain injury. British Journal of Anaesthesia. 125 (1), 77-86 (2020).
  14. Scharenbrock, A. R., Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Interactions among genetic background, anesthetic agent, and oxygen concentration shape blunt traumatic brain injury outcomes in Drosophila melanogaster. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6926 (2020).
  15. Fischer, J. A., Olufs, Z. P. G., Katzenberger, R. J., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Anesthetics influence mortality in a Drosophila model of blunt trauma with traumatic brain injury. Anesthesia & Analgesia. 126 (6), 1979-1986 (2018).
  16. Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
  17. Katzenberger, R. J., et al. A method to inflict closed head traumatic brain injury in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (100), e52905 (2015).
  18. Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-nuclear interactions affecting lifespan and neurodegeneration in a Drosophila model of Leigh syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
  19. Johnson-Schlitz, D., et al. Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).
  20. Li, H., et al. Isoflurane postconditioning reduces ischemia-induced nuclear factor-kappaB activation and interleukin 1beta production to provide neuroprotection in rats and mice. Neurobiology of Disease. 54, 216-224 (2013).
  21. Leibovitch, B. A., Campbell, D. B., Krishnan, K. S., Nash, H. A. Mutations that affect ion channels change the sensitivity of Drosophila melanogaster to volatile anesthetics. Journal of Neurogenetics. 10 (1), 1-13 (1995).
  22. Tinklenberg, J. A., Segal, I. S., Guo, T. Z., Maze, M. Analysis of anesthetic action on the potassium channels of the Shaker mutant of Drosophila. Annals of the New York Academy of Sciences. 625, 532-539 (1991).
  23. Gamo, S., Ogaki, M., Nakashima-Tanaka, E. Strain differences in minimum anesthetic concentrations in Drosophila melanogaster. Anesthesiology. 54 (4), 289-293 (1981).
  24. Campbell, J. L., Nash, H. A. The visually-induced jump response of Drosophila melanogaster is sensitive to volatile anesthetics. Journal of Neurogenetics. 12 (4), 241-251 (1998).
  25. Perouansky, M., Hentschke, H., Perkins, M., Pearce, R. A. Amnesic concentrations of the nonimmobilizer 1,2-dichlorohexafluorocyclobutane (F6, 2N) and isoflurane alter hippocampal theta oscillations in vivo. Anesthesiology. 106 (6), 1168-1176 (2007).

Tags

Serial Anesthesia ArrayVolatile AgentsDrosophila MelanogasterPharmacogeneticsAnesthesiaHigh-throughput ProcessingGenetic ToolboxVolatile AgentsPollutantsTherapeutic AgentsToxic EffectsBeneficial EffectsGeneticsWooden Frame50 Ml Conical Tube Caps5 Ml Serological PipettesNettingAdhesive Cable Tie DownsTygon TubingFlow IndicatorVaporizerCarrier Gas TankRegulator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Olufs, Z. P. G., Johnson-Schlitz, D., Wassarman, D. A., Perouansky, M. The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (192), e65144, doi:10.3791/65144 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image