JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

מערך ההרדמה הסדרתי לחקירה בתפוקה גבוהה של חומרים נדיפים באמצעות Drosophila melanogaster

Published: February 24, 2023
doi:
10.3791/65144
, , ,
1Department of Anesthesiology,University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medical Genetics,University of Wisconsin-Madison

Summary

זבוב הפירות (Drosophila melanogaster) נמצא בשימוש נרחב למחקר ביולוגי וטוקסיקולוגי. כדי להרחיב את התועלת של זבובים, פיתחנו מכשיר, מערך הרדמה סדרתית, שחושף בו זמנית דגימות זבובים מרובות להרדמה כללית נדיפה (VGAs), מה שמאפשר לחקור את ההשפעות הנלוות (רעילות ומגוננות) של VGAs.

Abstract

חומרי הרדמה כללית נדיפים (VGAs) נמצאים בשימוש ברחבי העולם על מיליוני אנשים בכל הגילאים והמצבים הרפואיים. ריכוזים גבוהים של VGAs (מאות מיקרומולרים עד מילימולרים נמוכים) נחוצים כדי להשיג דיכוי עמוק ולא פיזיולוגי של תפקוד המוח המוצג כ”הרדמה” לצופה. הספקטרום המלא של ההשפעות הנלוות המופעלות על ידי ריכוזים כה גבוהים של חומרים ליפופיליים אינו ידוע, אך אינטראקציות עם המערכת החיסונית-דלקתית צוינו, אם כי משמעותן הביולוגית אינה מובנת.

כדי לחקור את ההשפעות הביולוגיות של VGAs על בעלי חיים, פיתחנו מערכת המכונה מערך הרדמה טורית (SAA) כדי לנצל את היתרונות הניסיוניים שמציע זבוב הפירות (Drosophila melanogaster). SAA מורכב משמונה תאים המסודרים בסדרות ומחוברים לזרימה משותפת. חלקים מסוימים זמינים במעבדה, ואחרים ניתנים לייצור או רכישה בקלות. וופורייזר, הנחוץ לניהול מכויל של VGAs, הוא הרכיב היחיד המיוצר באופן מסחרי. VGAs מהווים רק אחוז קטן מהאטמוספירה הזורמת דרך SAA במהלך הפעולה, שכן הרוב (בדרך כלל מעל 95%) הוא גז נושא; ספק ברירת המחדל הוא אוויר. עם זאת, חמצן וכל גזים אחרים ניתן לחקור.

היתרון העיקרי של SAA על פני מערכות קודמות הוא שהוא מאפשר חשיפה בו זמנית של קבוצות מרובות של זבובים למינונים מדויקים של VGAs. ריכוזים זהים של VGAs מושגים בתוך דקות בכל החדרים, ובכך מספקים תנאי ניסוי שלא ניתן להבחין ביניהם. כל תא יכול להכיל מזבוב בודד ועד מאות זבובים. לדוגמה, SAA יכול לבחון בו זמנית שמונה גנוטיפים שונים או ארבעה גנוטיפים עם משתנים ביולוגיים שונים (למשל, זכר לעומת נקבה, זקנים לעומת צעירים). השתמשנו ב-SAA כדי לחקור את הפרמקודינמיקה של VGAs ואת האינטראקציות הפרמקוגנטיות שלהם בשני מודלים ניסיוניים של זבובים הקשורים למוטציות נוירו-דלקתיות-מיטוכונדריאליות ולפגיעה מוחית טראומטית (TBI).

Introduction

קיומן של השפעות הרדמה בטחונות (כלומר, השפעות שאינן נצפות באופן מיידי אך עשויות להיות בעלות השלכות התנהגותיות מאוחרות) מקובל בדרך כלל, אך הבנת המנגנונים וגורמי הסיכון שלהן נותרה בסיסית 1,2. הביטוי המושהה והעדינות שלהם מגבילים את מספר המשתנים החשובים האפשריים שניתן לחקור במודלים של יונקים במסגרות זמן סבירות ובמחיר מקובל. זבוב הפירות (Drosophila melanogaster) מציע יתרונות ייחודיים בהקשר של מחלות נוירודגנרטיביות3 ולבדיקות טוקסיקולוגיות4 שעד כה לא יושמו בחקר השפעות הרדמה.

פיתחנו את מערך ההרדמה הטורית (SAA) כדי להקל על השימוש בזבובי פירות בחקר פרמקודינמיקה הרדמה ופרמקוגנטיקה. יתרון מרכזי של SAA הוא חשיפה בו זמנית לתנאי ניסוי זהים של קבוצות מרובות. בשילוב עם הגמישות הניסויית של זבובי פירות, התפוקה הגבוהה של SAA מאפשרת לחקור משתנים ביולוגיים וסביבתיים בקנה מידה בלתי אפשרי במודלים של יונקים.

באופן עקרוני, SAA הוא פשוט סדרה של מקומות הרדמה מחוברים (תאים עשויים בקבוקונים 50 מ”ל) שדרכם גז המוביל מספק חומרים נדיפים. התא הראשון של המערכת מכיל מים מזוקקים שדרכם עובר לחות לגז המוביל (זבובים רגישים להתייבשות), והוא מסתיים במחוון זרימה פשוט המציין את זרימת הגז במערכת. רשתות עדינות המונחות על פתחי צינורות החיבור מפרידות בין התאים כדי למנוע נדידת זבובים בין החדרים. מספר המקומות “בסדרה” מוגבל על ידי ההתנגדות לזרימת גז ללא לחץ (צינורות, רשתות).

אפיינו את הקינטיקה של אב טיפוס SAA זה בפרסום קודם5. למרות שהתכונות הפרמקוקינטיות המדויקות ישתנו בין SAAs, היסודות הרלוונטיים שנבדקו בניסוי הם כדלקמן: (i) זרימה התחלתית של 1.5-2 L/min מאזנת את כל התאים (נפח כולל של ±550 מ”ל) עם ריכוז ההרדמה הרצוי תוך 2 דקות; (2) ריכוז אדי ההרדמה המועברים לתאים אינו משתנה במידה ניכרת בין המיקום הראשון לאחרון משום שכמות חומר ההרדמה הכלולה בנפח הגז בתא בודד (50 מ”ל) עולה בהרבה על הכמות הנלקחת על ידי מספר כלשהו של זבובים; ו-(iii) לאחר שהתאים מתאזנים, ניתן להפחית את זרימת הגז המוביל (50-100 מ”ל/דקה או פחות) כדי למנוע בזבוז וזיהום הסביבה (להרדמה נדיפה יש תכונות של גזי חממה). הזרימה המינימלית הדרושה לשמירה על ריכוז אדים במצב קבוע תלויה בעיקר בדליפה של SAA, שכן ספיגת האדים על ידי הזבובים היא זניחה. בתנאים סטנדרטיים אלה (2% איזופלורן ו-1.5 ליטר/דקה), הזבובים מורדמים (כלומר, לא ניידים) בכל עמדות המערך תוך 3-4 דקות, עם הבדלים בלתי מורגשים בין העמדות. VGAs יכולים להינתן במשך דקות עד שעות, ופרדיגמות החשיפה האופייניות שלנו הן בטווח של 15 דקות עד שעתיים. כדי לשטוף את המערכת, הוופורייזר כבוי, והזרימה נשמרת כדי להחליף בערך פי 10 נפחים של המערך (1.5 ליטר/דקה למשך 5 דקות). מהירות חיסול ההרדמה תשתנה עם קצב הזרימה שנקבע.

חומרי הרדמה נדיפים מתקשרים עם מטרות רבות שעדיין לא זוהו, כולל המערכת החיסונית-דלקתית6. התרומה של מטרות מולקולריות בודדות לתוצאות ראשוניות לעומת אדירות (“מצב הרדמה” לעומת “תופעות לוואי” לטווח ארוך וקצר) אינה מובנת היטב. לכן, מערכת זבובים רגישה ובעלת תפוקה גבוהה היא בעלת ערך כדי לסייע בניסויים בבעלי חיים גבוהים יותר, למרות ההבדלים הברורים בין זבובים ליונקים7. הבדלים מסוימים יכולים, למעשה, להיות יתרון; לדוגמה, מערכת החיסון של הזבוב שונה מזו של בעלי חיים גבוהים יותר בכך שהיא חסרה את הזרוע הנרכשת של התגובה8. למרות שזה אולי נראה כמו מגבלה להבנת מחלות בבני אדם, זה מציע הזדמנות ייחודית לחקור את האינטראקציה של VGAs עם התגובה החיסונית-דלקתית המולדת בבידוד מהתגובה האדפטיבית9. זה מאפשר מחקרים על ההשפעות הפרמקולוגיות של VGA על דלקת ואפנון שלהם על ידי הרקע הגנטי המגוון הקיים באוכלוסייה.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים המשמשים בפרוטוקול. 1. בניית ה-SAA צרו את המסגרת על-ידי חיתוך עץ והרכבת המסגרת באמצעות המידות שבאיור 1A. שנה 50 מ”ל מכסי צינור חרוט.קדח שני חורים בכל מכסה עם מקדח 9/32 בסיבית. חול את החורים כדי לנקות את הפלסטיק המרופט. חול, החלק העליון של הכובע כדי לחספס את פני השטח (זה עוזר עם הדבקת דבק). חתכו 5 מ”ל פיפטות סרולוגיות לגודל (3 אינץ’ לזרימה ו-1.5 אינץ’ ליציאה) על ידי ניקוד הפלסטיק ואז שבירתו לקו הניקוד. חולצים את קצות הפיפטות החתוכות/שבורות. יש להדביק רשת לצינורות (לאפשר זמן ייבוש מתאים לדבק). חותכים את הרשת לגודל הצינור לאחר שהדבק מתייבש. הכנס את הצינורות לתוך החורים של כובעי החרוט עם שני צינורות המשתרעים (3/4 אינץ ‘) מעל המכסה; ודא שצינור הזרימה נמשך זמן רב יותר לתוך הצינור מאשר הזרימה החוצה (איור 1B). יש למרוח דבק על החלק העליון של הפקקים סביב הצינורות כדי להצמיד את החלקים זה לזה (לאפשר זמן ייבוש מתאים לדבק לפני שתמשיך). חברו את הכובעים למסגרת ונתבו את הצינור (איור 1C).חברו למסגרת אזיקוני כבלים דביקים (במרחק של 3.25 אינץ’ זה מזה, ממרכז למרכז). הצמד את הכובעים למסגרת באמצעות אזיקונים; גזור את הקצוות של תג האזיקון קצר. חתכו וחברו אורכים (9 אינץ’) של צינורות טייגון לצינורות הכניסה/יציאה בכל מכסה שונה (איור 1D). החל מהקצה במעלה הזרם, התחבר תחילה לזרימה, ולאחר מכן חבר צינורות מהזרימה החוצה לזרימה של המיקום הבא. הוסיפו מחוון זרימה ל”זרימה” במורד הזרם (מיקום 10, איור 1E). הניחו צינור חרוטי בנפח 50 מ”ל במיקום הראשון, ומלאו אותו במים ממש מתחת לצינור הזרימה (איור 1F). הכינו את התממשקות למכשיר האידוי. הסירו את הבוכנות, חתכו חריצים משני מזרקים בנפח 10 מ”ל (1/2 אינץ’ עומק x 1/4 אינץ’ רוחב, איור 1G), והכניסו אותם לתוך זרם הוופורייזר והחוצה כשהחריצים פונים ישירות לכיוון החלק הקדמי של הוופורייזר כדי ליישר קו עם החורים (איור 1H). אופציונלי: הדביקו את המזרקים שעברו שינוי למקומם. אם המחיר משתלם, השתמש בסעפת מסחרית (ראה את טבלת החומרים עבור אפשרות אחת). חבר את המערכת כולה. השתמש בצינורות Tygon כדי לחבר את הרכיבים יחד בסדר הבא: מיכל גז מוביל עם וסת > מד זרימה ספציפי לגז > וופורייזר > SAA (איור 1C). מלא עמדות ריקות במערך עם צינורות חרוטיים ריקים של 50 מ”ל. הפעל את מיכל הדלק, פתח את מד הזרימה ל ~ 2 ליטר לדקה, והפעל את הוופורייזר ל- 0%. אשר את זרימת הגז דרך המערכת על ידי בדיקת מד הזרימה במעלה הזרם של הוופורייזר ומחוון הזרימה במורד הזרם של החדר האחרון של SAA לזרימה. לחלופין, הכניסו את קצה הצינור במורד הזרם למים, וחפשו בועות.הערה: מכיוון שהמערכת אינה בלחץ, עמוד מים גבוה מכמה סנטימטרים יעצור את הזרימה. אם אין זרימה בקצה במורד הזרם של המערך, בדוק את הדברים הבאים: הוופורייזר צריך להיות מופעל כדי לאפשר זרימה; לבדוק כי וסת המיכל ומדי זרימה מאפשרים זרימה; בדוק את מיקומי המערך כדי לוודא שהצינורות מוברגים בחוזקה; ולבדוק אם יש נזילות סביב הדבק על הפקקים ששונו. איור 1: בניית SAA. (A) סכמטי, עם מדידות, של מסגרת העץ התומכת ב-SAA. (B) חתך סכמטי, עם מדידות, של מכסה שונה עם צינורות זרימה וזרימה העשויים פיפטות סרולוגיות של 5 מ”ל. (C) SAA מורכב (שהועתק מ- Olufs et al.5) (D) פרטים של מכסה חרוטי שונה של 50 מ”ל המציג צינורות זרימה ויציאה. (E) זרימה במורד הזרם (מיקום 10) עם מחוון הזרימה. (F) במעלה הזרם (עמדה 1) צינור מלא מים כדי לחלח את גז המוביל. החץ האדום מציין את מפלס המים. (G) שונה מזרק 10 מ”ל ניפוק עבור סעפת מאולתרת. העיגול האדום מדגיש את החריץ המקוצץ הממוקם בין 8 מ”ל ל- 10 מ”ל (או 1/2 אינץ ‘x 1/4 אינץ’). (H) מבט אחורי על מכשיר האידוי Tec7 המראה את ההכנסה והכיוון של המזרקים ששונו. רק מזרק אחד נמצא במקום בתצוגה זו כדי להראות, משמאל, את החור (חץ אדום) שצריך להיות מיושר עם החריץ של המזרק שונה. הערה: אי התאמה של חריץ חתך זה ופתח הזרימה החוצה ישבשו את מתן ההרדמה. חלק זה הוא נקודת תורפה פוטנציאלית במערכת מותאמת אישית זו. אם יש כספים זמינים, יש להשתמש בסעפת מסחרית. קיצור: SAA = מערך הרדמה טורית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 2. לפני חשיפה להרדמה עשרים וארבע שעות או יותר לפני החשיפה להרדמה, מיין את קבוצות הזבובים לפי הצורך לניסוי בשיטה המועדפת (למשל,CO2 או אתר). 3. הפעלת ה-SAA מעבירים זבובים מבקבוקוני מזון לצינורות חרוטיים ריקים של 50 מ”ל (ללא CO2).ספור ותעד זבובים מתים לפני החשיפה. פתח את המכסה והבריג צינורות חרוטי 50 מ”ל עם זבובים על SAA. הפעל את גז המוביל והגדר לקצב הזרימה הרצוי.הערה: בדרך כלל אנו משתמשים ב-1-2 ליטר/דקה. כוונו את מכשיר ההרדמה לריכוז הרצוי.הערה: בדרך כלל אנו משתמשים ב-2% עבור איזופלורן ו-3.5% עבור סבופלורן, שהם מינונים שווי ערך ביונקים10. חשוף את הזבובים למשך הזמן הרצוי (דקות: 15 דקות).הערה: מומלץ זמן חשיפה מינימלי של 15 דקות כדי למנוע שונות אפשרית בשיווי משקל בין מיקומי SAA. במערכת זו, לוקח 2-3 דקות עד שחומרי ההרדמה מתאזנים בכל התנוחות. בתום החשיפה, שטפו את המערכת בזרימת גז טרי (וופורייזר מוגדר ל-0%) ב-1.5 ליטר/דקה למשך 5 דקות, בהתאמה לנפחים של כ-10x מנפח SAA הכולל. 4. רשימת תיוג לפני תחילת ניסוי פתח את וסת הלחץ הגבוה (על גבי מיכל האוויר) לחלוטין, ולאחר מכן סגור אותו חצי סיבוב כדי להבטיח זרימת גז מוביל. עקוב אחר צינורות עבור כל קו ל- i) מדי זרימה ו- ii) וופורייזר (ודא שהזרימה / הזרימה מחוברת כראוי), ו- iii) בדוק את רמת ההרדמה במכשירי האידוי. לאחר העמסת התאים בנבדקים, בדקו שהאוויר/גז זורם עם בדיקת הבועות או מחוון הזרימה.הערה: מכשירי אידוי מסוימים אינם מאפשרים זרימת אוויר כאשר החוגה נמצאת במצב כבוי. כאשר הגז זורם, ודא שגם מד הזרימה וגם מחוון הזרימה במורד הזרם מצביעים על זרימה. בסוף הניסוי, לאפשר 4-5 דקות של זרימת אוויר כדי לשטוף את חומר ההרדמה.

Representative Results

קישור וידאו SAA מסופק כאן: שיטות מחקר Perouansky – המחלקה להרדמה – UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) המעבדה שלנו השתמשה ב- SAA כדי (i) לחקור את השפעת הגנוטיפ על רגישות התנהגותית להרדמה5; (ii) בדיקת מוטציות מיטוכונדריאליות להשפעות נלוות של חומרי הרדמה11; ו-(iii) לחקור את הפרמקודינמיקה של איזופלורן וסבופלורן על תוצאות בפגיעה מוחית טראומטית (TBI)12,13,14,15,16,17. התוצאות שפורסמו מראות בבירור כי הרקע הגנטי משפיע על הפרמקודינמיקה של VGAs בשימוש קליני הן ביחס לפנוטיפ הקונבנציונלי של הרדמה והן להשפעות הנלוות של רעילות הרדמה, כמו גם הגנה על רקמות 5,11,13,14,15. דוגמה מייצגת 1 (איור 2): סחף גנטי בעמידות לרעילות איזופלורנית שזוהה על-ידי תנאי ניסוי אמינים הניתנים לשחזורהגילוי של שינוי כמותי הדרגתי בתמותה הנגרמת על ידי VGA בקרב זבובי ND2360114 בתרבית נפרדת הוא דוגמה לתועלת של השוואות אמינות של פרמקודינמיקה בהרדמה בין קבוצות ניסוי באמצעות SAA. ND23 הוא גן המקודד תת-יחידה בליבת קומפלקס I של mETC (מקביל ל-Ndufs8 ביונקים)18. מוטציות בתת-יחידה זו הן הגורם לתסמונת לי, מחלה מיטוכונדריאלית קטלנית. נצפתה היחלשות הדרגתית של פנוטיפ התמותה הנגרמת על ידי איזופלורן לאורך זמן במלאי הומוזיגוטי ND2360114 שונים שגודלו בתרבית בו זמנית בתנאי מעבדה סטנדרטיים (כלומר, ללא חשיפה ל-VGA). הסתגלות אבולוציונית זו לרעילות איזופלורנית התרחשה בהיעדר כל חשיפה ל-VGAs והיא ככל הנראה השפעה נלווית של “הישרדות החזקים” בתוך המניות המוטנטיות. שינוי הדרגתי זה ברגישות לאיזופלורן היה נשאר בלתי מוכר ללא ביטחוננו שתנאי הניסוי היו זהים לאורך כל הבדיקות ולאורך זמן. אנו מסיקים כי הבחירה מעדיפה משנים של ההשפעות של ND2360114, עם עמידות מוגברת מקרית לרעילות איזופלורן. מכיוון שדלקת במערכת העצבים המרכזית ממלאת תפקיד חשוב בפתוגנזה של תסמונת לי, האבולוציה העדית של עמידות עשויה לנבוע משינויים אדפטיביים בתגובה החיסונית-דלקתית המולדת, כאשר עמידות לרעילות איזופלורן היא תוצר לוואי מקרי. איור 2: שונות בתמותה כתוצאה מלחץ אבולוציוני בזבובי ND2360114. שבעה קווים (A-G) שבודדו מאוכלוסייה אחת באמצעות הזדווגות של זוג יחיד, הורחבו ונבדקו לתמותה של 24 שעות (PM24) לאחר חשיפה של שעתיים לאיזופלורן 2% (בגיל 10-13 ימים) מראים שונות בפנוטיפ הנובע מאוכלוסייה אחת. הנתונים מוצגים כחלקות קופסה ושפם. הקופסאות מייצגות את הרביעון השני והשלישי של הנתונים, כאשר השפם משתרע לנקודות הנתונים המינימליות והמקסימליות. הממוצע והחציון מסומנים על ידי “+” וקווים אופקיים, בהתאמה. אחוזי התמותה של הבודדים המשוכפלים (N) מוצגים כמעגלים. N = 3-4 בקבוקונים של 20-50 זבובים/בקבוקון. ערך P עבור ANOVA חד-כיווני רגיל; p = 0.012 מצביע על הבדל משמעותי בין האמצעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. דוגמה מייצגת 2 (איור 3): המחשה של יישום בתפוקה גבוהה של SAA כדי לחשוף השפעות רקע גנטיות על פרמקודינמיקה איזופלורניתכדוגמה לתפוקה הגבוהה של המערכת, איור 3 מדגים את ההשפעות של חשיפות זהות לאיזופלורן (15 דקות של 2% איזופלורן) לפני פגיעה מוחית טראומטית (TBI)16, פרוטוקול הבודק התניה מוקדמת של הרדמה (AP) במודל הזבוב הזה13,15,19. הקריאה היא תמותה 24 שעות לאחר תיקון TBI לשחיקה טבעית (MI24). במודל הזה, כל הזבובים חזרו לניידות (כלומר, היו בחיים) בתוך 30 דקות אחרי TBI, והתמותה שנרשמה ב-MI24 הייתה תוצאה של פגיעה מוחית משנית (sBI). בארבעת קווי הזבוב, AP עם איזופלורן הפחית את ה-MI24 בדרגות שונות, מה שמצביע על כך שהיענות ל-AP היא תכונה כמותית. מכיוון שהתגובה הדלקתית היא גורם חשוב בתחלואה מ-sBI, AP עשוי לכלול אפנון של מערכת החיסון20. איור 3: השפעת רקע גנטי על דיכוי תמותה (MI24) על-ידי התניה מוקדמת עם איזופלורן. זבובים עם 15 דקות של 2% איזופלורן (סגול) הפחיתו את מדד התמותה ב-24 שעות (MI24) בזנים W 1118 ו-y 1w1118 (p < 0.0001 ו-p = 0.036, בהתאמה). ה-MI24 לא היה נמוך משמעותית בקווי אורגון R (OR) וקנטון S (CS) (p = 0.16 ו-p = 0.27, בהתאמה). הנתונים מוצגים כחלקות קופסה ושפם. הקופסאות מייצגות את הרביעון השני והשלישי של הנתונים, כאשר השפם משתרע לנקודות הנתונים המינימליות והמקסימליות. הממוצע והחציון מסומנים על ידי “+” וקווים אופקיים, בהתאמה. ערכי MI24 של המשוכפלים הבודדים (N) מוצגים כמעגלים. N = 15-33 בקבוקונים של 30-40 זבובים/בקבוקון עבור זבובים שטופלו ב-TBI. N = 2-15 בקבוקונים של 30-40 זבובים/בקבוקון לבקרות לא מטופלות. ערכי P ממבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

צעדים קריטיים בבניית SAA כוללים הבטחת אביזרים הדוקים כדי למנוע דליפה של תערובת הגזים המרדימים. ה-SAA חייב להיות ממוקם במכסה אדים כדי למנוע זיהום של חלל המעבדה. יש לבדוק את כל האלמנטים מבלוני הגז המוביל למחוון הזרימה במורד הזרם של SAA כמפורט ברשימת התיוג.

שיטות אחרות למתן VGAs לזבובים מסובכות לתפעול (השיכרון)21, בעלות תפוקה נמוכה 22, אינן מאפשרות חשיפה בו זמנית של אוכלוסיות מרובות 23, אינן מאפשרות בקרה מדויקת על ריכוז חומר ההרדמה 21, או בעלות קריאה שקשה לתרגם למונחים מקובלים קלינית 24.

הגרסה הנוכחית של SAA מסתמכת על וופורייזר מסחרי, ולכן מחקרים טוקסיקולוגיים מוגבלים להרדמה נדיפה. אם משתמשים בו עם חומרים נדיפים אחרים, ניתן להשתמש בוופורייזר “מחוץ לתווית” לאחר כיול הפלט. לחילופין, ניתן ליישם שיטה אחרת לאידוי החומרים הנדיפים, שתדרוש מדידות ייעודיות לטיטרציה של ריכוזי התרופה, כפי שתואר קודם לכן25.

מלבד מחווני הזרימה, אין אזעקות (כלומר, אם המיכלים מתרוקנים, הזרימה דרך SAA תופרע). בהתאם לעוצמת השימוש, SAA עשוי להזדקק לניקוי, הידוק ואולי החלפה של צינורות טייגון. ביצענו “תחזוקה” ב-SAA המקורי שלנו פעמיים ב-7 שנות שימוש.

שיטה זו להרדים זבובי פירות מאפשרת שימוש בארגז הכלים הגנטי העומד לרשות חוקרי דרוזופילה במערכת בעלת תפוקה גבוהה. קבוצות מרובות של זבובים מאוכלוסיות שונות (למשל, גנוטיפ, גיל, מין) יכולות להיחשף בו זמנית לריכוזי הרדמה זהים ולשילוב הרצוי של גז נשא (אוויר, O 2, N2 O, גזים אצילים) המתאים לשאלת המחקר העומדת על הפרק.

אנו מראים כאן כי SAA היה שימושי לחשיפת שינויים בלתי צפויים בעמידות לרעילות איזופלורן בקו הזבובים ND2360114 וכי קווי זבוב מעבדה סטנדרטיים שונים בתגובתם ל- AP. זיהוי ממצאים אלה התאפשר הודות לבקרה ההדוקה של תנאי הניסוי והתפוקה הגבוהה של SAA.

ניתן להתאים את SAA לחקר ההשפעות של תרכובות אורגניות נדיפות אחרות (VOC) על חרקים (למשל, דבורי דבש). עבור תרכובות אורגניות נדיפות עם לחצי אדים קרובים לאלה של חומרי הרדמה נדיפים (איזופלורן: 240 מ”מ כספית ב-20°C), ניתן להשתמש בוופורייזרים קונבנציונליים, אך יהיה צורך לכייל את הפלט. הוופורייזר המסחרי עבור desflurane מחומם, מה שעשוי להציע גמישות נוספת.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים למארק ג. פרקינס, מעבדת פירס, המחלקה להרדמה, אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון, על בניית אב הטיפוס של SAA. העבודה נתמכת על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (NIGMS) עם R01GM134107 ועל ידי קרן המו”פ של המחלקה להרדמה, אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.

Materials

Serial Anesthesia Array: 
5 mL Serological Pipettes Fisher Scientific 13-676-10C Polystyrene, 5mL serological pipette
50 mL Conical Tubes Fisher Scientific 1495949A Polypropylene, 50 mL
Cable Tie Mounting Pad Grainger 6EEE6 1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H
Dispensing Syringe Grainger 5FVE0 10 mL with Luer-Lock Connection
Fabric Mesh Netting 1 mm mesh
Flow Indicator Grainger 8RH52 5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style
Tygon Tubing Tygon E-3603 ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16
Wood Frame 10 feet of 2 inch x 3/4 inch
Zip Tie >5inch
Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold):
Dispensing Syringe Grainger 5FVE0 10 mL with Luer-Lock Connection
Commercial Manifold and Vaporizers:
1/4 inch Equal Barbed Y Connector Somni Scientific BF-9000
1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic) Somni Scientific BF-9004
AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob Somni Scientific FP-4002
Flowmeter auxiliary mounting bracket Somni Scientific NonInvPart
Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male Somni Scientific GF-11012
TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included) Somni Scientific TT-17000
Tec 7 Isoflurane Vaporizer GE Datex-Ohmeda 1175-9101-000 Agent-specific vaporizer (Isoflurane)
Tec 7 Sevoflurane Vaporizer GE Datex-Ohmeda 1175-9301-000 Agent-specific vaporizer (Sevoflurane)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jevtovic-Todorovic, V., et al. Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits. The Journal of Neuroscience. 23 (3), 876-882 (2003).
  2. Vutskits, L., Xie, Z. Lasting impact of general anaesthesia on the brain: Mechanisms and relevance. Nature Reviews Neuroscience. 17 (11), 705-717 (2016).
  3. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  4. Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
  5. Olufs, Z. P. G., Loewen, C. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Genetic variability affects absolute and relative potencies and kinetics of the anesthetics isoflurane and sevoflurane in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 8, 2348 (2018).
  6. Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
  7. Yamaguchi, M., Yoshida, H. . Drosophila as a model organism. In Drosophila Models for Human Diseases., edited by. , 1-10 (2018).
  8. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
  9. Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster-From microbial recognition to whole-organism physiology. Nature Reviews Immunology. 14 (12), 796-810 (2014).
  10. Shaughnessy, M. R., Hofmeister, E. H. A systematic review of sevoflurane and isoflurane minimum alveolar concentration in domestic cats. Veterinary Anaesthesia and Analgesia. 41 (1), 1-13 (2014).
  11. Olufs, Z. P. G., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Mitochondrial complex I mutations predispose Drosophila to isoflurane neurotoxicity. Anesthesiology. 133 (4), 839-851 (2020).
  12. Johnson-Schlitz, D., et al. Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).
  13. Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Lasarev, M. R., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Ageing and genetic background influence anaesthetic effects in a D. melanogaster model of blunt trauma with brain injury. British Journal of Anaesthesia. 125 (1), 77-86 (2020).
  14. Scharenbrock, A. R., Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Interactions among genetic background, anesthetic agent, and oxygen concentration shape blunt traumatic brain injury outcomes in Drosophila melanogaster. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6926 (2020).
  15. Fischer, J. A., Olufs, Z. P. G., Katzenberger, R. J., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Anesthetics influence mortality in a Drosophila model of blunt trauma with traumatic brain injury. Anesthesia & Analgesia. 126 (6), 1979-1986 (2018).
  16. Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
  17. Katzenberger, R. J., et al. A method to inflict closed head traumatic brain injury in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (100), e52905 (2015).
  18. Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-nuclear interactions affecting lifespan and neurodegeneration in a Drosophila model of Leigh syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
  19. Johnson-Schlitz, D., et al. Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).
  20. Li, H., et al. Isoflurane postconditioning reduces ischemia-induced nuclear factor-kappaB activation and interleukin 1beta production to provide neuroprotection in rats and mice. Neurobiology of Disease. 54, 216-224 (2013).
  21. Leibovitch, B. A., Campbell, D. B., Krishnan, K. S., Nash, H. A. Mutations that affect ion channels change the sensitivity of Drosophila melanogaster to volatile anesthetics. Journal of Neurogenetics. 10 (1), 1-13 (1995).
  22. Tinklenberg, J. A., Segal, I. S., Guo, T. Z., Maze, M. Analysis of anesthetic action on the potassium channels of the Shaker mutant of Drosophila. Annals of the New York Academy of Sciences. 625, 532-539 (1991).
  23. Gamo, S., Ogaki, M., Nakashima-Tanaka, E. Strain differences in minimum anesthetic concentrations in Drosophila melanogaster. Anesthesiology. 54 (4), 289-293 (1981).
  24. Campbell, J. L., Nash, H. A. The visually-induced jump response of Drosophila melanogaster is sensitive to volatile anesthetics. Journal of Neurogenetics. 12 (4), 241-251 (1998).
  25. Perouansky, M., Hentschke, H., Perkins, M., Pearce, R. A. Amnesic concentrations of the nonimmobilizer 1,2-dichlorohexafluorocyclobutane (F6, 2N) and isoflurane alter hippocampal theta oscillations in vivo. Anesthesiology. 106 (6), 1168-1176 (2007).

Tags

Serial Anesthesia ArrayVolatile AgentsDrosophila MelanogasterPharmacogeneticsAnesthesiaHigh-throughput ProcessingGenetic ToolboxVolatile AgentsPollutantsTherapeutic AgentsToxic EffectsBeneficial EffectsGeneticsWooden Frame50 Ml Conical Tube Caps5 Ml Serological PipettesNettingAdhesive Cable Tie DownsTygon TubingFlow IndicatorVaporizerCarrier Gas TankRegulator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Olufs, Z. P. G., Johnson-Schlitz, D., Wassarman, D. A., Perouansky, M. The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (192), e65144, doi:10.3791/65144 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image