Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) è ampiamente utilizzato per la ricerca biologica e tossicologica. Per espandere l’utilità delle mosche, abbiamo sviluppato uno strumento, l’array di anestesia seriale, che espone simultaneamente più campioni di mosca agli anestetici generali volatili (VGA), rendendo possibile studiare gli effetti collaterali (tossici e protettivi) dei VGA.
Gli anestetici generali volatili (VGA) sono utilizzati in tutto il mondo su milioni di persone di tutte le età e condizioni mediche. Alte concentrazioni di VGA (centinaia di micromolari a basso millimolare) sono necessarie per ottenere una soppressione profonda e non fisiologica della funzione cerebrale che si presenta come “anestesia” all’osservatore. L’intero spettro degli effetti collaterali innescati da concentrazioni così elevate di agenti lipofili non è noto, ma sono state notate interazioni con il sistema immuno-infiammatorio, sebbene il loro significato biologico non sia compreso.
Per studiare gli effetti biologici dei VGA negli animali, abbiamo sviluppato un sistema chiamato serial anesthesia array (SAA) per sfruttare i vantaggi sperimentali offerti dal moscerino della frutta (Drosophila melanogaster). Il SAA è costituito da otto camere disposte in serie e collegate a un afflusso comune. Alcune parti sono disponibili in laboratorio e altre possono essere facilmente fabbricate o acquistate. Un vaporizzatore, necessario per la somministrazione calibrata di VGA, è l’unico componente prodotto commercialmente. I VGA costituiscono solo una piccola percentuale dell’atmosfera che scorre attraverso l’ASA durante il funzionamento, poiché la maggior parte (in genere oltre il 95%) è costituita da gas di trasporto; Il vettore predefinito è Air. Tuttavia, l’ossigeno e qualsiasi altro gas possono essere studiati.
Il principale vantaggio della SAA rispetto ai sistemi precedenti è che consente l’esposizione simultanea di più coorti di mosche a dosi esattamente titolabili di VGA. Concentrazioni identiche di VGA vengono raggiunte in pochi minuti in tutte le camere, fornendo così condizioni sperimentali indistinguibili. Ogni camera può contenere da una singola mosca a centinaia di mosche. Ad esempio, la SAA può esaminare simultaneamente otto diversi genotipi o quattro genotipi con diverse variabili biologiche (ad esempio, maschio vs femmina, vecchio vs giovane). Abbiamo utilizzato la SAA per studiare la farmacodinamica dei VGA e le loro interazioni farmacogenetiche in due modelli sperimentali di mosca associati a mutanti neuroinfiammatori-mitocondriali e lesioni cerebrali traumatiche (TBI).
L’esistenza di effetti anestetici collaterali (cioè effetti che non sono immediatamente osservabili ma possono avere conseguenze comportamentali ritardate) è generalmente accettata, ma la comprensione dei loro meccanismi e fattori di rischio rimane rudimentale 1,2. La loro manifestazione ritardata e la loro sottigliezza limitano il numero di variabili potenzialmente importanti che possono essere studiate nei modelli di mammiferi in tempi ragionevoli e ad un costo accettabile. Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) offre vantaggi unici nel contesto della malattia neurodegenerativa3 e per lo screening tossicologico4 che non sono stati, ad oggi, applicati allo studio degli effetti collaterali anestetici.
Abbiamo sviluppato il serial anesthesia array (SAA) per facilitare l’uso dei moscerini della frutta nello studio della farmacodinamica anestetica e della farmacogenetica. Un vantaggio chiave della SAA è l’esposizione simultanea a condizioni sperimentali identiche di più coorti. Se abbinato alla flessibilità sperimentale dei moscerini della frutta, l’elevata produttività della SAA consente l’esplorazione di variabili biologiche e ambientali su una scala impossibile nei modelli di mammiferi.
In linea di principio, il SAA è semplicemente una serie di luoghi anestetizzanti collegati (camere fatte di fiale da 50 ml) attraverso le quali un gas vettore rilascia agenti volatili. La prima camera del sistema contiene acqua distillata attraverso la quale viene umidificato il gas di trasporto (le mosche sono sensibili alla disidratazione) e termina con un semplice indicatore di flusso che indica il flusso di gas attraverso il sistema. Reti sottili poste sulle aperture dei tubi di collegamento separano le camere per impedire la migrazione delle mosche tra le camere. Il numero di posizioni “in serie” è limitato dalla resistenza al flusso di gas non pressurizzato (tubi, reti).
Abbiamo caratterizzato la cinetica di questo prototipo SAA in una precedente pubblicazione5. Sebbene le esatte proprietà farmacocinetiche varino tra i SAA, le basi rilevanti che sono state testate sperimentalmente sono le seguenti: (i) un flusso iniziale di 1,5-2 L/min equilibra tutte le camere (volume totale di ±550 ml) con la concentrazione desiderata di anestetico entro 2 minuti; ii) la concentrazione di vapore anestetico erogato alle camere non cambia sensibilmente tra la prima e l’ultima posizione, poiché la quantità di anestetico contenuta nel volume di gas in una singola camera (50 ml) supera di gran lunga la quantità assorbita da un numero qualsiasi di mosche; e (iii) una volta che le camere si sono equilibrate, il flusso di gas di trasporto può essere ridotto (50-100 ml / min o meno) per evitare sprechi e contaminazione dell’ambiente (gli anestetici volatili hanno proprietà di gas serra). Il flusso minimo necessario per mantenere una concentrazione stazionaria di vapore dipende principalmente dalla perdita del SAA, poiché l’assorbimento di vapore da parte delle mosche è trascurabile. In queste condizioni standard (2% di isoflurano e 1,5 L/min di flusso di gas di trasporto), le mosche sono anestetizzate, cioè immobili) in tutte le posizioni dell’array entro 3-4 minuti, con differenze impercettibili tra le posizioni. I VGA possono essere somministrati per minuti o ore e i nostri paradigmi di esposizione tipici sono compresi tra 15 minuti e 2 ore. Per lavare il sistema, il vaporizzatore viene spento e il flusso viene mantenuto per scambiare circa 10 volumi dell’array (1,5 L / min per 5 minuti). La velocità di eliminazione dell’anestetico varierà con la velocità di flusso impostata.
Gli agenti anestetici volatili interagiscono con numerosi bersagli ancora non identificati, incluso il sistema immuno-infiammatorio6. Il contributo dei singoli bersagli molecolari agli esiti primari rispetto a quelli collaterali (lo “stato anestetico” rispetto agli “effetti collaterali” a lungo e breve termine) è poco compreso. Pertanto, un sistema di mosca sensibile e ad alto rendimento è prezioso per informare gli esperimenti negli animali superiori, nonostante le ovvie differenze tra mosche e mammiferi7. Alcune differenze possono, infatti, essere vantaggiose; Ad esempio, il sistema immunitario della mosca differisce da quello degli animali superiori in quanto manca del braccio adattativo della risposta8. Sebbene questo possa sembrare un limite per la comprensione della malattia negli esseri umani, offre un’opportunità unica per studiare l’interazione dei VGA con la risposta immuno-infiammatoria innata in isolamento dalla risposta adattativa9. Ciò consente di studiare gli effetti farmacologici dei VGA sull’infiammazione e la loro modulazione da parte dei vari background genetici presenti in una popolazione.
I passaggi critici nella costruzione del SAA includono la garanzia di raccordi ermetici per evitare perdite della miscela anestetica di gas. L’ASA deve essere alloggiato in una cappa aspirante per evitare la contaminazione dello spazio del laboratorio. Tutti gli elementi, dalle bombole del gas di trasporto all’indicatore di flusso a valle dell’ASA, devono essere controllati come indicato nella lista di controllo.
Altri metodi di somministrazione di VGA ai moscerini sono complicati da utilizzare (l’inebriometro)21, hanno un basso throughput 22, non consentono l’esposizione simultanea di più popolazioni 23, non consentono un controllo preciso della concentrazione anestetica21 o hanno una lettura difficile da tradurre in termini clinicamente accettati 24.
L’attuale versione del SAA si basa su un vaporizzatore commerciale e, quindi, gli studi tossicologici sono limitati agli anestetici volatili. Se usato con altre sostanze volatili, un vaporizzatore potrebbe essere usato “off label” dopo aver calibrato l’uscita. In alternativa, potrebbe essere applicato un metodo diverso di vaporizzazione delle sostanze volatili, che richiederebbe misurazioni dedicate per titolare le concentrazioni del farmaco, come descritto in precedenza25.
A parte gli indicatori di flusso, non ci sono allarmi (cioè, se i serbatoi si svuotano, il flusso attraverso l’ASA verrà interrotto). A seconda dell’intensità dell’uso, potrebbe essere necessario pulire, serrare ed eventualmente sostituire il tubo Tygon. Abbiamo eseguito “manutenzione” sul nostro SAA originale due volte in 7 anni di utilizzo.
Questo metodo per anestetizzare i moscerini della frutta consente l’uso della cassetta degli attrezzi genetica disponibile per i ricercatori di Drosophila in un sistema ad alto rendimento. Coorti multiple di moscerini di diverse popolazioni (ad esempio, genotipo, età, sesso) possono essere esposte simultaneamente a concentrazioni anestetiche identiche e alla combinazione desiderata di gas vettore (aria, O 2, N2O, gas nobili) adatta alla domanda di ricerca in questione.
Mostriamo qui che la SAA è stata utile per rivelare cambiamenti inaspettati nella resilienza alla tossicità dell’isoflurano nella linea di volo ND2360114 e che le linee di volo di laboratorio standard differiscono nella loro risposta all’AP. L’identificazione di questi risultati è stata possibile grazie allo stretto controllo delle condizioni sperimentali e all’elevato rendimento della SAA.
La SAA può essere adattata per studiare gli effetti di altri composti organici volatili (COV) sugli insetti (ad esempio, le api mellifere). Per i COV con pressioni di vapore vicine a quelle degli anestetici volatili (isoflurano: 240 mmHg a 20 °C), potrebbero essere utilizzati vaporizzatori convenzionali, ma l’uscita dovrebbe essere calibrata. Il vaporizzatore commerciale per desflurano è riscaldato, offrendo potenzialmente ulteriore flessibilità.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Mark G. Perkins, Pearce Laboratory, Dipartimento di Anestesiologia, Università del Wisconsin-Madison, per la costruzione del prototipo SAA. Il lavoro è supportato dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) con R01GM134107 e dal fondo di ricerca e sviluppo del Dipartimento di Anestesiologia, Università del Wisconsin-Madison.
Serial Anesthesia Array: | |||
5 mL Serological Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10C | Polystyrene, 5mL serological pipette |
50 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 1495949A | Polypropylene, 50 mL |
Cable Tie Mounting Pad | Grainger | 6EEE6 | 1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H |
Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
Fabric Mesh Netting | 1 mm mesh | ||
Flow Indicator | Grainger | 8RH52 | 5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style |
Tygon Tubing | Tygon | E-3603 | ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16 |
Wood Frame | 10 feet of 2 inch x 3/4 inch | ||
Zip Tie | >5inch | ||
Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold): | |||
Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
Commercial Manifold and Vaporizers: | |||
1/4 inch Equal Barbed Y Connector | Somni Scientific | BF-9000 | |
1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic) | Somni Scientific | BF-9004 | |
AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob | Somni Scientific | FP-4002 | |
Flowmeter auxiliary mounting bracket | Somni Scientific | NonInvPart | |
Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male | Somni Scientific | GF-11012 | |
TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included) | Somni Scientific | TT-17000 | |
Tec 7 Isoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9101-000 | Agent-specific vaporizer (Isoflurane) |
Tec 7 Sevoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9301-000 | Agent-specific vaporizer (Sevoflurane) |