JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

De seriële anesthesie-array voor het high-throughput onderzoek van vluchtige stoffen met behulp van Drosophila melanogaster

Published: February 24, 2023
doi:
10.3791/65144
, , ,
1Department of Anesthesiology,University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medical Genetics,University of Wisconsin-Madison

Summary

De fruitvlieg (Drosophila melanogaster) wordt veel gebruikt voor biologisch en toxicologisch onderzoek. Om het nut van vliegen uit te breiden, ontwikkelden we een instrument, de seriële anesthesie-array, die tegelijkertijd meerdere vliegenmonsters blootstelt aan vluchtige algemene anesthetica (VGA’s), waardoor het mogelijk wordt om de neveneffecten (toxisch en beschermend) van VGA’s te onderzoeken.

Abstract

Vluchtige algemene anesthetica (VGA’s) worden wereldwijd gebruikt bij miljoenen mensen van alle leeftijden en medische aandoeningen. Hoge concentraties VGAs (honderden micromolaire tot lage millimolaire) zijn nodig om een diepgaande en onfysiologische onderdrukking van de hersenfunctie te bereiken die zich presenteert als “anesthesie” voor de waarnemer. Het volledige spectrum van de neveneffecten veroorzaakt door dergelijke hoge concentraties lipofiele middelen is niet bekend, maar interacties met het immuun-inflammatoire systeem zijn opgemerkt, hoewel hun biologische betekenis niet wordt begrepen.

Om de biologische effecten van VGA’s bij dieren te onderzoeken, ontwikkelden we een systeem genaamd de seriële anesthesie-array (SAA) om de experimentele voordelen van de fruitvlieg (Drosophila melanogaster) te benutten. De SAA bestaat uit acht kamers die in serie zijn gerangschikt en verbonden zijn met een gemeenschappelijke instroom. Sommige onderdelen zijn beschikbaar in het laboratorium en andere kunnen gemakkelijk worden vervaardigd of gekocht. Een vaporizer, die nodig is voor de gekalibreerde toediening van VGAs, is het enige commercieel vervaardigde onderdeel. VGA’s vormen slechts een klein percentage van de atmosfeer die tijdens bedrijf door de SAA stroomt, aangezien het grootste deel (meestal meer dan 95%) dragergas is; De standaard luchtvaartmaatschappij is Air. Wel kunnen zuurstof en eventuele andere gassen onderzocht worden.

Het belangrijkste voordeel van de SAA ten opzichte van eerdere systemen is dat het de gelijktijdige blootstelling van meerdere cohorten vliegen aan precies titreerbare doses VGA’s mogelijk maakt. Identieke concentraties VGA’s worden binnen enkele minuten in alle kamers bereikt, waardoor niet van elkaar te onderscheiden experimentele omstandigheden worden verkregen. Elke kamer kan van een enkele vlieg tot honderden vliegen bevatten. De SAA kan bijvoorbeeld tegelijkertijd acht verschillende genotypen of vier genotypen met verschillende biologische variabelen onderzoeken (bijvoorbeeld mannelijk versus vrouwelijk, oud versus jong). We hebben de SAA gebruikt om de farmacodynamiek van VGA’s en hun farmacogenetische interacties te onderzoeken in twee experimentele vliegmodellen geassocieerd met neuro-inflammatie-mitochondriale mutanten en traumatisch hersenletsel (TBI).

Introduction

Het bestaan van collaterale anesthetische effecten (d.w.z. effecten die niet onmiddellijk waarneembaar zijn, maar vertraagde gedragsgevolgen kunnen hebben) is algemeen aanvaard, maar het begrip van hun mechanismen en risicofactoren blijft rudimentair 1,2. Hun vertraagde manifestatie en subtiliteit beperken het aantal potentieel belangrijke variabelen die binnen redelijke termijnen en tegen aanvaardbare kosten in zoogdiermodellen kunnen worden onderzocht. De fruitvlieg (Drosophila melanogaster) biedt unieke voordelen in de context van neurodegeneratieve ziekte3 en voor toxicologische screening4 die tot op heden niet zijn toegepast op de studie van anesthetische neveneffecten.

We ontwikkelden de seriële anesthesie-array (SAA) om het gebruik van fruitvliegjes in de studie van anesthesiefarmacodynamiek en farmacogenetica te vergemakkelijken. Een belangrijk voordeel van de SAA is de gelijktijdige blootstelling aan identieke experimentele omstandigheden van meerdere cohorten. In combinatie met de experimentele flexibiliteit van fruitvliegen, maakt de hoge doorvoer van de SAA de verkenning van biologische en omgevingsvariabelen mogelijk op een schaal die onmogelijk is in zoogdiermodellen.

In principe is de SAA gewoon een reeks verbonden verdovingslocaties (kamers gemaakt van injectieflacons van 50 ml) waardoor een dragergas vluchtige stoffen aflevert. De eerste kamer van het systeem bevat gedestilleerd water waardoor het dragergas wordt bevochtigd (vliegen zijn gevoelig voor uitdroging) en het eindigt met een eenvoudige stroomindicator die de gasstroom door het systeem aangeeft. Fijne netten geplaatst op de openingen van de verbindingsbuizen scheiden de kamers om de migratie van vliegen tussen de kamers te voorkomen. Het aantal locaties “in serie” wordt beperkt door de weerstand tegen de drukloze gasstroom (buizen, netten).

We hebben de kinetiek van dit SAA-prototype gekarakteriseerd in een eerdere publicatie5. Hoewel de exacte farmacokinetische eigenschappen zullen variëren tussen SAAs, zijn de relevante basisprincipes die experimenteel zijn getest als volgt: (i) een initiële stroom van 1,5-2 l / min brengt alle kamers (totaal volume van ±550 ml) in evenwicht met de gewenste concentratie van anestheticum binnen 2 minuten; ii) de concentratie van de verdovingsdamp die aan de kamers wordt afgegeven, niet merkbaar verandert tussen de eerste en de laatste plaats, omdat de hoeveelheid verdovingsmiddel in het gasvolume in een individuele kamer (50 ml) de hoeveelheid die door een willekeurig aantal vliegen wordt opgenomen, ver overschrijdt; en (iii) zodra de kamers in evenwicht zijn gebracht, kan de dragergasstroom worden verminderd (50-100 ml / min of minder) om verspilling en verontreiniging van het milieu te voorkomen (vluchtige anesthetica hebben broeikasgaseigenschappen). De minimale stroom die nodig is om een steady-state concentratie van damp te handhaven, hangt voornamelijk af van de lekheid van de SAA, omdat de opname van damp door de vliegen verwaarloosbaar is. Onder deze standaardomstandigheden (2% isofluraan en 1,5 L/min dragergasstroom) worden vliegen binnen 3-4 minuten verdoofd (d.w.z. onbeweeglijk) in alle posities van de array, met onmerkbare verschillen tussen posities. VGAs kunnen minuten tot uren worden toegediend en onze typische blootstellingsparadigma’s liggen in het bereik van 15 minuten tot 2 uur. Om het systeem te spoelen, wordt de vaporizer uitgeschakeld en wordt de stroom gehandhaafd om ongeveer 10x volumes van de array te wisselen (1,5 l/min gedurende 5 minuten). De snelheid van de eliminatie van anesthesie zal variëren met de ingestelde stroomsnelheid.

Vluchtige anesthetica interageren met tal van nog niet geïdentificeerde doelen, waaronder het immuun-inflammatoire systeem6. De bijdrage van individuele moleculaire doelwitten aan primaire versus collaterale uitkomsten (de “anesthesietoestand” versus lange en korte termijn “bijwerkingen”) is slecht begrepen. Daarom is een gevoelig, high-throughput vliegensysteem waardevol om experimenten bij hogere dieren te informeren, ondanks de duidelijke verschillen tussen vliegen en zoogdieren7. Sommige verschillen kunnen zelfs voordelig zijn; Het immuunsysteem van de vlieg verschilt bijvoorbeeld van dat van hogere dieren doordat het de adaptieve arm van de respons8 mist. Hoewel dit misschien een beperking lijkt voor het begrijpen van ziekte bij mensen, biedt het een unieke kans om de interactie van VGA’s met de aangeboren immuun-inflammatoire reactie te bestuderen in isolatie van de adaptieve respons9. Dit maakt studies mogelijk van de farmacologische effecten van VGA op ontsteking en hun modulatie door de verschillende genetische achtergronden die aanwezig zijn in een populatie.

Protocol

OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen die in het protocol worden gebruikt. 1. Bouw van de SAO Maak het frame door hout te snijden en het frame te monteren met behulp van de afmetingen in figuur 1A. Wijzig 50 ml conische buisdoppen.Boor twee gaten in elke dop met een 9/32 in boor. Schuur de gaten om het rafelige plastic op te ruimen. Schuur de bovenkant van de dop om het oppervlak op te ruwen (dit helpt bij lijmhechting). Snijd 5 ml serologische pipetten op maat (3 in voor instroom en 1,5 in voor uitstroom) door het plastic te scoren en vervolgens schoon te breken op de gescoorde lijn. Schuur de uiteinden van de gesneden/gebroken pipetten. Lijm gaas op de buizen (zorg voor een goede droogtijd voor de lijm). Knip het gaas op de grootte van de buis nadat de lijm is opgedroogd. Steek de buizen in de gaten van de conische doppen met beide buizen die zich uitstrekken (3/4 in) boven de dop; ervoor zorgen dat de instroombuis langer in de buis steekt dan de uitstroom (figuur 1B). Breng lijm aan op de bovenkanten van de doppen rond de buizen om de onderdelen aan elkaar te bevestigen (zorg voor een goede droogtijd voor de lijm voordat u doorgaat). Bevestig de doppen aan het frame en leid de buizen (figuur 1C).Bevestig zelfklevende kabelbevestigingen aan het frame (3,25 uit elkaar, van midden naar midden). Bevestig de doppen aan het frame met behulp van ritsbanden; knip de uiteinden van de ritssluiting kort. Knip en verbind lengtes (9 inch) van Tygon-buizen met de in- en uitstroombuizen op elke gewijzigde dop (figuur 1D). Begin aan het stroomopwaartse uiteinde, bevestig eerst aan de instroom en bevestig vervolgens de buizen van de uitstroom aan de instroom van de volgende positie. Voeg een stroomindicator toe aan de meest stroomafwaartse “instroom” (positie 10, figuur 1E). Plaats een conische buis van 50 ml op de eerste positie en vul deze met water tot net onder de instroombuis (figuur 1F). Bereid de interfacing voor de vaporizer voor. Verwijder de zuigers, knip inkepingen uit twee doseerspuiten van 10 ml (1/2 in diep x 1/4 in breed, figuur 1G) en steek ze in de in- en uitstroom van de verdamper met de inkepingen direct naar de voorkant van de verdamper gericht om uit te lijnen met de gaten (figuur 1H). Optioneel: Lijm de aangepaste spuiten op hun plaats. Indien betaalbaar, gebruik dan een commercieel spruitstuk (zie de Tabel met materialen voor één optie). Sluit het hele systeem aan. Gebruik Tygon-buizen om de componenten in de volgende volgorde aan elkaar te bevestigen: dragergastank met regelaar > gasspecifieke flowmeter > verdamper > SAA (figuur 1C). Vul lege posities op de array met lege conische buizen van 50 ml. Zet de gastank aan, open de flowmeter tot ~2 L/min en zet de vaporizer aan op 0%. Bevestig de gasstroom door het systeem door de flowmeter stroomopwaarts van de vaporizer en de stroomindicator stroomafwaarts van de laatste kamer van de SAA te controleren op stroming. U kunt ook het stroomafwaartse uiteinde van de buis in water steken en op zoek gaan naar bellen.OPMERKING: Omdat het systeem niet onder druk staat, zal een waterkolom hoger dan een paar centimeter de stroom stoppen. Als er geen stroom is aan het stroomafwaartse uiteinde van de array, controleer dan het volgende: de vaporizer moet aan staan om stroming mogelijk te maken; controleer of de tankregelaar en debietmeters debiet toelaten; controleer de arrayposities om ervoor te zorgen dat de buizen stevig zijn vastgeschroefd; en controleer op lekken rond de lijm op de gemodificeerde doppen. Figuur 1: Constructie van de SAA. (A) Schematisch, met metingen, van het houten frame dat de SAA ondersteunt. (B) Geschematiseerde doorsnede, met metingen, van een gewijzigde dop met in- en uitstroombuizen gemaakt van serologische pipetten van 5 ml. (C) Geassembleerde SAA (gereproduceerd uit Olufs et al.5) (D) Details van een gemodificeerde conische kap van 50 ml met in- en uitstroombuizen. (E) Stroomafwaartse (positie 10) uitstroom met de stroomindicator. (F) Stroomopwaarts (positie 1) met water gevulde buis om het dragergas te bevochtigen. De rode pijl geeft de waterstand aan. (G) Gemodificeerde doseerspuit van 10 ml voor het geïmproviseerde spruitstuk. De rode cirkel markeert de uitgesneden inkeping tussen de markeringen van 8 ml en 10 ml (of 1/2 in x 1/4 in). (H) Achteraanzicht van de Tec7-verdamper met het inbrengen en de oriëntatie van de gemodificeerde spuiten. In deze weergave is slechts één spuit aanwezig om aan de linkerkant het gat (rode pijl) weer te geven dat moet worden uitgelijnd met de inkeping van de gemodificeerde spuit. Opmerking: Een verkeerde uitlijning van deze uitsparing en de uitstroomopening zal de toediening van anesthesie verstoren. Dit onderdeel is een potentiële zwakke plek in dit op maat gemaakte systeem. Als er fondsen beschikbaar zijn, moet een commercieel spruitstuk worden gebruikt. Afkorting: SAA = serial anesthesia array. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Voorafgaand aan blootstelling aan anesthetische Vierentwintig uur of meer voorafgaand aan de blootstelling aan anesthetica, sorteer de vliegcohorten indien nodig voor het experiment met behulp van de voorkeursmethode (bijv. CO2 of ether). 3. Werking van de SAO Breng vliegen over van voedselflacons in lege conische buisjes van 50 ml (zonder CO2).Tel en noteer dode vliegen voorafgaand aan blootstelling. Ontkap en schroef 50 ml conische buizen met vliegen op de SAA. Schakel het dragergas in en stel het gewenste debiet in.OPMERKING: We gebruiken meestal 1-2 L / min. Stel de verdovingsverdamper in op de gewenste concentratie.OPMERKING: We gebruiken meestal 2% voor isofluraan en 3,5% voor sevofluraan, wat equipotente doses zijn bij zoogdieren10. Stel de vliegen bloot voor de gewenste duur (min: 15 min).OPMERKING: Een minimale blootstellingstijd van 15 minuten wordt aanbevolen om mogelijke variabiliteit in evenwicht tussen de posities van de SAA te voorkomen. In dit systeem duurt het 2-3 minuten voordat de anesthetica in alle posities in evenwicht zijn. Aan het einde van de blootstelling spoelt u het systeem met een verse gasstroom (verdamper ingesteld op 0%) bij 1,5 l/min gedurende 5 minuten, wat overeenkomt met ongeveer 10x de volumes van het totale SAA-volume. 4. Checklist voordat u een experiment start Open de hogedrukregelaar (bovenop de luchttank) volledig en sluit deze vervolgens een halve slag om de gasstroom van de drager te garanderen. Volg de slang voor elke lijn naar de i) flowmeters en ii) vaporizer (zorg ervoor dat de in- en uitstroom correct is aangesloten) en iii) controleer het verdovingsniveau in de vaporizers. Controleer na het laden van de kamers met proefpersonen of de lucht / gas stroomt met de bellentest of de stroomindicator.OPMERKING: Sommige vaporizers laten geen luchtstroom toe wanneer de draaiknop in de uit-stand staat. Wanneer er gas stroomt, controleert u of zowel de debietmeter als de stroomafwaartse stroomindicator de stroom aangeven. Laat aan het einde van het experiment 4-5 minuten luchtstroom om het verdovingsmiddel uit te spoelen.

Representative Results

Een SAA-videolink wordt hier aangeboden: Perouansky Research Methods – Department of Anesthesiology – UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Ons lab heeft de SAA gebruikt om (i) het effect van genotype op gedragsgevoeligheid voor anesthetica te bestuderen5; ii) mitochondriale mutanten screenen op de neveneffecten van anesthetica11; en (iii) de farmacodynamiek van isofluraan en sevofluraan onderzoeken op uitkomsten bij traumatisch hersenletsel (TBI)12,13,14,15,16,17. De gepubliceerde resultaten tonen duidelijk aan dat de genetische achtergrond de farmacodynamiek van klinisch gebruikte VGA’s beïnvloedt met betrekking tot zowel het conventionele fenotype van anesthesie als de neveneffecten van anesthesietoxiciteit, evenals weefselbescherming 5,11,13,14,15. Representatief voorbeeld 1 (figuur 2):Genetische afwijking in veerkracht tegen isofluraantoxiciteit gedetecteerd door betrouwbaar reproduceerbare experimentele omstandighedenDe ontdekking van een geleidelijke kwantitatieve verandering in VGA-geïnduceerde mortaliteit bij afzonderlijk gekweekte ND2360114-vliegen is een voorbeeld van het nut van betrouwbare vergelijkingen van anesthetische farmacodynamiek tussen experimentele groepen met behulp van de SAA. ND23 is een gen dat codeert voor een subeenheid in de kern van Complex I van de mETC (analoog aan Ndufs8 bij zoogdieren)18. Mutaties in deze subeenheid zijn een oorzaak van het syndroom van Leigh, een dodelijke mitochondriale ziekte. We zagen een geleidelijke verzwakking van het door isofluraan geïnduceerde sterftefenotype in de loop van de tijd in verschillende homozygote ND2360114-bestanden die gelijktijdig werden gekweekt onder standaard laboratoriumomstandigheden (d.w.z. zonder blootstelling aan VGA’s). Deze evolutionaire aanpassing aan isofluraantoxiciteit vond plaats in afwezigheid van blootstelling aan VGA’s en is waarschijnlijk een neveneffect van “survival of the fittest” binnen de mutante bestanden. Deze geleidelijke verandering in isofluraangevoeligheid zou niet herkend zijn gebleven zonder ons vertrouwen dat de experimentele omstandigheden identiek waren in de testen en in de loop van de tijd. We concluderen dat selectie modifiers van de effecten van ND2360114 begunstigt, met toevallig verhoogde veerkracht tegen isofluraantoxiciteit. Aangezien ontsteking in het centrale zenuwstelsel een belangrijke rol speelt in de pathogenese van het syndroom van Leigh, kan de waargenomen evolutie van resistentie te wijten zijn aan adaptieve veranderingen in de aangeboren immuun-inflammatoire reactie, waarbij resistentie tegen isofluraantoxiciteit een toevallig bijproduct is. Figuur 2: Variatie in door isofluraan toxiciteit geïnduceerde mortaliteit als gevolg van evolutionaire druk in ND2360114-vliegen. Zeven lijnen (A-G) geïsoleerd uit een enkele populatie door middel van paringen met één paar, uitgebreid en getest op 24-uurssterfte (PM24) na een blootstelling van 2 uur aan 2% isofluraan (op 10-13 dagen oud) vertonen variabiliteit in het fenotype dat voortkomt uit een enkele populatie. Gegevens weergegeven als box- en whiskerplots. De vakken vertegenwoordigen het tweede en derde kwartiel van de gegevens, waarbij de snorharen zich uitstrekken tot de minimale en maximale gegevenspunten. Het gemiddelde en de mediaan worden aangegeven met respectievelijk “+” en horizontale lijnen. Het percentage sterfte van de individuele replicaties (N) wordt weergegeven als cirkels. N = 3-4 injectieflacons van 20-50 vliegen/injectieflacon. P-waarde voor een gewone eenrichtings-ANOVA; p = 0,012 duidt op een significant verschil tussen de gemiddelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Representatief voorbeeld 2 (figuur 3): Illustratie van een high-throughput toepassing van de SAA om genetische achtergrondeffecten op isofluraan farmacodynamiek te onthullenAls voorbeeld van de hoge doorvoer van het systeem illustreert figuur 3 de effecten van identieke blootstelling aan isofluraan (15 min van 2% isofluraan) voorafgaand aan traumatisch hersenletsel (TBI)16, een protocol dat anesthesievoorconditionering (AP) test in dit vliegmodel13,15,19. De aflezing is mortaliteit 24 h na TBI gecorrigeerd voor natuurlijke attritie (MI24). In dit model herwonnen alle vliegen mobiliteit (d.w.z. waren ze in leven) binnen 30 minuten na TBI, en de mortaliteit geregistreerd in de MI24 was een gevolg van secundair hersenletsel (sBI). In de vier vlieglijnen verminderde AP met isofluraan de MI24 in verschillende mate, wat aangeeft dat responsiviteit op AP een kwantitatief kenmerk is. Aangezien de ontstekingsreactie een belangrijke factor is in de morbiditeit van sBI, kan AP modulatie van het immuunsysteem omvatten20. Figuur 3: Invloed van genetische achtergrond op de onderdrukking van mortaliteit (MI24) door voorconditionering met isofluraan. Voorconditioneringsvliegen met 15 min 2% isofluraan (paars) verlaagden de sterfte-index na 24 h (MI24) in w 1118 en y1w1118 stammen (p < 0,0001 en p = 0,036, respectievelijk). De MI 24 was niet significant lager in de geconditioneerde Oregon R (OR) en Canton S (CS) lijnen (p = 0,16 en p =0,27, respectievelijk). Gegevens weergegeven als box- en whiskerplots. De vakken vertegenwoordigen het tweede en derde kwartiel van de gegevens, waarbij de snorharen zich uitstrekken tot de minimale en maximale gegevenspunten. Het gemiddelde en de mediaan worden aangegeven met respectievelijk “+” en horizontale lijnen. De MI24-waarden van de afzonderlijke replicaties (N) worden weergegeven als cirkels. N = 15-33 injectieflacons met 30-40 vliegen/injectieflacons voor met TBI behandelde vliegen. N = 2-15 injectieflacons met 30-40 vliegen/injectieflacons voor onbehandelde controles. P-waarden van een ongepaarde, tweezijdige Student’s t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Kritieke stappen in de constructie van de SAA omvatten het zorgen voor strakke fittingen om lekkage van het verdovingsmengsel van gassen te voorkomen. De SAA moet worden ondergebracht in een zuurkast om verontreiniging van de laboratoriumruimte te voorkomen. Alle elementen van de dragergasflessen tot de stroomindicator stroomafwaarts van de SAO moeten worden gecontroleerd zoals beschreven in de controlelijst.

Andere methoden voor het toedienen van VGA’s aan vliegen zijn ingewikkeld om te bedienen (de inebriometer)21, hebben een lage doorvoer 22, staan de gelijktijdige blootstelling van meerdere populaties niet toe23, laten geen nauwkeurige controle van de anesthesieconcentratietoe 21, of hebben een uitlezing die moeilijk te vertalen is in klinisch geaccepteerde termen 24.

De huidige versie van de SAA is gebaseerd op een commerciële vaporizer en daarom zijn toxicologische studies beperkt tot vluchtige anesthetica. Bij gebruik met andere vluchtige stoffen kan een vaporizer “off label” worden gebruikt na het kalibreren van de output. Als alternatief zou een andere methode voor het verdampen van de vluchtige stoffen kunnen worden toegepast, waarvoor speciale metingen nodig zijn om de medicijnconcentraties te titreren, zoals eerder beschreven25.

Afgezien van de stroomindicatoren zijn er geen alarmen (d.w.z. als de tanks leeg zijn, wordt de stroom door de SAA onderbroken). Afhankelijk van de intensiteit van het gebruik, moet de SAA mogelijk worden gereinigd, aangescherpt en mogelijk vervangen door de Tygon-buizen. We hebben twee keer “onderhoud” uitgevoerd aan onze originele SAA in 7 jaar gebruik.

Deze methode voor het verdoven van fruitvliegen maakt het mogelijk om de genetische gereedschapskist te gebruiken die beschikbaar is voor Drosophila-onderzoekers in een high-throughput-systeem. Meerdere cohorten vliegen van verschillende populaties (bijv. Genotype, leeftijd, geslacht) kunnen tegelijkertijd worden blootgesteld aan identieke anesthesieconcentraties en de gewenste combinatie van dragergas (lucht, O 2, N2 O, edelgassen) die geschikt zijn voor de betreffende onderzoeksvraag.

We laten hier zien dat de SAA nuttig is geweest voor het onthullen van onverwachte veranderingen in de veerkracht tegen isofluraantoxiciteit in de ND2360114-vlieglijn en dat standaard laboratoriumvlieglijnen verschillen in hun responsiviteit op AP. Het identificeren van deze bevindingen was mogelijk vanwege de strakke controle van de experimentele omstandigheden en de hoge doorvoer van de SAA.

De SAA kan worden aangepast om de effecten van andere vluchtige organische stoffen (VOS) op insecten (bijv. honingbijen) te bestuderen. Voor VOS met een dampdruk die dicht bij die van vluchtige anesthetica ligt (isofluraan: 240 mmHg bij 20 °C), kunnen conventionele verdampers worden gebruikt, maar de output moet worden gekalibreerd. De commerciële vaporizer voor desfluraan wordt verwarmd, wat mogelijk extra flexibiliteit biedt.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Mark G. Perkins, Pearce Laboratory, Department of Anesthesiology, University of Wisconsin-Madison, voor de bouw van het SAA-prototype. Het werk wordt ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) met R01GM134107 en door het R&D-fonds van de afdeling Anesthesiologie, University of Wisconsin-Madison.

Materials

Serial Anesthesia Array: 
5 mL Serological Pipettes Fisher Scientific 13-676-10C Polystyrene, 5mL serological pipette
50 mL Conical Tubes Fisher Scientific 1495949A Polypropylene, 50 mL
Cable Tie Mounting Pad Grainger 6EEE6 1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H
Dispensing Syringe Grainger 5FVE0 10 mL with Luer-Lock Connection
Fabric Mesh Netting 1 mm mesh
Flow Indicator Grainger 8RH52 5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style
Tygon Tubing Tygon E-3603 ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16
Wood Frame 10 feet of 2 inch x 3/4 inch
Zip Tie >5inch
Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold):
Dispensing Syringe Grainger 5FVE0 10 mL with Luer-Lock Connection
Commercial Manifold and Vaporizers:
1/4 inch Equal Barbed Y Connector Somni Scientific BF-9000
1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic) Somni Scientific BF-9004
AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob Somni Scientific FP-4002
Flowmeter auxiliary mounting bracket Somni Scientific NonInvPart
Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male Somni Scientific GF-11012
TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included) Somni Scientific TT-17000
Tec 7 Isoflurane Vaporizer GE Datex-Ohmeda 1175-9101-000 Agent-specific vaporizer (Isoflurane)
Tec 7 Sevoflurane Vaporizer GE Datex-Ohmeda 1175-9301-000 Agent-specific vaporizer (Sevoflurane)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jevtovic-Todorovic, V., et al. Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits. The Journal of Neuroscience. 23 (3), 876-882 (2003).
  2. Vutskits, L., Xie, Z. Lasting impact of general anaesthesia on the brain: Mechanisms and relevance. Nature Reviews Neuroscience. 17 (11), 705-717 (2016).
  3. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  4. Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
  5. Olufs, Z. P. G., Loewen, C. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Genetic variability affects absolute and relative potencies and kinetics of the anesthetics isoflurane and sevoflurane in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 8, 2348 (2018).
  6. Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
  7. Yamaguchi, M., Yoshida, H. . Drosophila as a model organism. In Drosophila Models for Human Diseases., edited by. , 1-10 (2018).
  8. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
  9. Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster-From microbial recognition to whole-organism physiology. Nature Reviews Immunology. 14 (12), 796-810 (2014).
  10. Shaughnessy, M. R., Hofmeister, E. H. A systematic review of sevoflurane and isoflurane minimum alveolar concentration in domestic cats. Veterinary Anaesthesia and Analgesia. 41 (1), 1-13 (2014).
  11. Olufs, Z. P. G., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Mitochondrial complex I mutations predispose Drosophila to isoflurane neurotoxicity. Anesthesiology. 133 (4), 839-851 (2020).
  12. Johnson-Schlitz, D., et al. Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).
  13. Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Lasarev, M. R., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Ageing and genetic background influence anaesthetic effects in a D. melanogaster model of blunt trauma with brain injury. British Journal of Anaesthesia. 125 (1), 77-86 (2020).
  14. Scharenbrock, A. R., Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Interactions among genetic background, anesthetic agent, and oxygen concentration shape blunt traumatic brain injury outcomes in Drosophila melanogaster. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6926 (2020).
  15. Fischer, J. A., Olufs, Z. P. G., Katzenberger, R. J., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Anesthetics influence mortality in a Drosophila model of blunt trauma with traumatic brain injury. Anesthesia & Analgesia. 126 (6), 1979-1986 (2018).
  16. Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
  17. Katzenberger, R. J., et al. A method to inflict closed head traumatic brain injury in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (100), e52905 (2015).
  18. Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-nuclear interactions affecting lifespan and neurodegeneration in a Drosophila model of Leigh syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
  19. Johnson-Schlitz, D., et al. Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).
  20. Li, H., et al. Isoflurane postconditioning reduces ischemia-induced nuclear factor-kappaB activation and interleukin 1beta production to provide neuroprotection in rats and mice. Neurobiology of Disease. 54, 216-224 (2013).
  21. Leibovitch, B. A., Campbell, D. B., Krishnan, K. S., Nash, H. A. Mutations that affect ion channels change the sensitivity of Drosophila melanogaster to volatile anesthetics. Journal of Neurogenetics. 10 (1), 1-13 (1995).
  22. Tinklenberg, J. A., Segal, I. S., Guo, T. Z., Maze, M. Analysis of anesthetic action on the potassium channels of the Shaker mutant of Drosophila. Annals of the New York Academy of Sciences. 625, 532-539 (1991).
  23. Gamo, S., Ogaki, M., Nakashima-Tanaka, E. Strain differences in minimum anesthetic concentrations in Drosophila melanogaster. Anesthesiology. 54 (4), 289-293 (1981).
  24. Campbell, J. L., Nash, H. A. The visually-induced jump response of Drosophila melanogaster is sensitive to volatile anesthetics. Journal of Neurogenetics. 12 (4), 241-251 (1998).
  25. Perouansky, M., Hentschke, H., Perkins, M., Pearce, R. A. Amnesic concentrations of the nonimmobilizer 1,2-dichlorohexafluorocyclobutane (F6, 2N) and isoflurane alter hippocampal theta oscillations in vivo. Anesthesiology. 106 (6), 1168-1176 (2007).

Tags

Serial Anesthesia ArrayVolatile AgentsDrosophila MelanogasterPharmacogeneticsAnesthesiaHigh-throughput ProcessingGenetic ToolboxVolatile AgentsPollutantsTherapeutic AgentsToxic EffectsBeneficial EffectsGeneticsWooden Frame50 Ml Conical Tube Caps5 Ml Serological PipettesNettingAdhesive Cable Tie DownsTygon TubingFlow IndicatorVaporizerCarrier Gas TankRegulator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Olufs, Z. P. G., Johnson-Schlitz, D., Wassarman, D. A., Perouansky, M. The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (192), e65144, doi:10.3791/65144 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image