העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה
Summary
פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.
Abstract
רוב החיידקים, כולל מיקובקטריה, מייצרים בועיות חוץ-תאיות (EV). מאחר שרכבים חשמליים חיידקיים (bEVs) מכילים תת-קבוצה של רכיבים תאיים, כולל מטבוליטים, שומנים, חלבונים וחומצות גרעין, מספר קבוצות העריכו את הגרסאות המקוריות או הרקומביננטיות של bEV על עוצמת ההגנה שלהן כמועמדים לחיסון תת-יחידתי. שלא כמו כלי רכב חשמליים מקומיים, כלי רכב חשמליים רקומביננטיים מהונדסים מולקולרית כך שיכילו אימונוגן אחד או יותר בעלי עניין. במהלך העשור האחרון, קבוצות שונות בחנו גישות מגוונות ליצירת bEV רקומביננטי. עם זאת, כאן אנו מדווחים על תכנון, בנייה והעשרה של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים רקומביננטיים (mEVs) במיקובקטריה. לשם כך, אנו משתמשים ב-Mycobacterium smegmatis (Msm), מיקובקטריום אדמה אלים כמערכת המודל. תחילה נתאר את היצירה וההעשרה של כלי רכב חשמליים מקומיים של Msm. לאחר מכן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של mEV רקומביננטי המכיל mCherry, חלבון כתב פלואורסצנטי אדום, או EsxA (Esat-6), אימונוגן בולט של Mycobacterium tuberculosis. אנו משיגים זאת על ידי מיזוג נפרד של mCherry ו- EsxA N-termini עם C-terminus של חלבון Msm קטן Cfp-29. Cfp-29 הוא אחד החלבונים הבודדים שנמצאים בשפע של MsmEVs. הפרוטוקול ליצירה והעשרה של mEV רקומביננטי מ-Msm נותר זהה ליצירה ולהעשרה של כלי רכב חשמליים מקוריים של Msm.
Introduction
למרות הפיתוח והניהול של מגוון רחב של חיסונים נגד מחלות זיהומיות, אפילו עד עצם היום הזה, ~ 30% מכלל מקרי המוות האנושיים עדיין מתרחשים ממחלות מידבקות1. לפני הופעת החיסון נגד שחפת – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – שחפת הייתה גורם התמותה מספר אחת (~10,000 עד 15,000/100,000 תושבים)2. עם מתן BCG וגישה קלה לתרופות קו ראשון ושני נגד שחפת, עד 2022, מקרי מוות הקשורים לשחפת ירדו באופן דרמטי ל~1 מיליון לשנה עד 2022 (כלומר, ~ 15-20/100,000 אוכלוסייה1). עם זאת, באוכלוסיות אנדמיות לשחפת בעולם, מקרי מוות הקשורים לשחפת ממשיכים לעמוד על ~ 100-550/100,000 אוכלוסייה1. בעוד מומחים מכירים במספר סיבות שהובילו למספרים מוטים אלה, נראה כי הגנה בתיווך BCG שאינה נמשכת אפילו בעשור הראשון לחיים היא הסיבה הבולטת 3,4,5,6,7. כתוצאה מכך, בהתחשב ב”יעדי פיתוח בר-קיימא” המחודשים של האו”ם וב”אסטרטגיית סוף השחפת” של ארגון הבריאות העולמי, ישנו מאמץ עולמי מרוכז לפתח חלופה חיסונית עדיפה בהרבה ל-BCG, שאולי מספקת הגנה לכל החיים מפני שחפת.
לקראת מטרה זו, מספר קבוצות מעריכות כעת זני BCG מותאמים/רקומביננטיים, זנים מיקובקטריאליים לא פתוגניים ומוחלשים שאינם BCG, ומועמדים לתת-יחידות 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . בדרך כלל, חיסונים תת-יחידות הם ליפוזומים הנטענים באופן סלקטיבי עם מעט חלבונים אימונוגניים מטוהרים (~1-6) באורך מלא או קטועים של הפתוגן. עם זאת, בגלל הקיפול המזויף שלהם לקונפורמציות לא ילידיות ו / או אינטראקציות אקראיות לא פונקציונליות בין החלבונים הטעונים, תת-יחידות חסרות לעתים קרובות אפיטופים מקומיים וגרמניים ולכן אינן מצליחות להכשיר מספיק את מערכת החיסון14,19,20.
כתוצאה מכך, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) של חיידקים תפסו תאוצה כחלופה מבטיחה 21,22,23,24,25,26. בדרך כלל, כלי רכב חשמליים חיידקיים (bEVs) מכילים תת-קבוצה של המרכיבים התאיים שלהם, כולל חלקים מסוימים של חומצות גרעין, שומנים ומאות מטבוליטים וחלבונים27,28. שלא כמו ליפוזומים שבהם כמה חלבונים מטוהרים נטענים באופן מלאכותי, bEV מכילים מאות חלבונים טעונים באופן טבעי, מקופלים באופן טבעי עם נטייה טובה יותר להפעיל את מערכת החיסון, במיוחד ללא דחיפה/סיוע של אדג’ובנטים ואגוניסטים לקולטן דמוי אגרה (TLR)27,28,29. בקו מחקר זה אנו ואחרים בחנו את התועלת של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים כמאיצי תת-יחידות פוטנציאליים ל-BCG30. למרות החששות כי bEVs חסרים עומסי אנטיגן אחידים, EVs מ Neisseria meningitidis מוחלש הגנו בהצלחה על בני אדם מפני מנינגוקוק serogroup B31,32.
לפחות תיאורטית, כלי הרכב החשמליים הטובים ביותר שיכולים להגביר היטב את BCG הם כלי הרכב החשמליים המועשרים מחיידקים פתוגניים. עם זאת, העשרת כלי רכב חשמליים הנוצרים על ידי מיקובקטריום פתוגני היא יקרה, גוזלת זמן ומסוכנת. בנוסף, כלי רכב חשמליים שנוצרו על ידי פתוגן עשויים להיות אלימים יותר מאשר מגנים. בהתחשב בסיכונים הפוטנציאליים, כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול בדוק היטב להעשרת כלי רכב חשמליים שנוצר על ידי Msm שגדל באופן אקסני, מיקובקטריום אלים.
עם זאת, למרות קידוד מספר אורתולוגים של חלבונים פתוגניים, מיקובקטריה אלימים חסרים מספר אנטיגנים חיסוניים / אפיטופים של חלבון פתוגני הדרושים כדי להכין מספיק את מערכת החיסון לקראת הגנה33. לכן, בחנו גם בנייה והעשרה של כלי רכב חשמליים רקומביננטיים של MSM באמצעות הנדסה מולקולרית, כך שחלק משמעותי מכל חלבון פתוגני בעל עניין המובע ומתורגם ב-MSM, חייב להגיע לרכבים החשמליים שלו. שיערנו כי אחד או יותר מ-10 החלבונים הנפוצים ביותר של Msm EVs כאשר הם מאוחים לחלבון המעניין יסייעו בטרנסלוקציה כזו.
בזמן שהתחלנו לתקנן את ההעשרה של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים (mEVs) במעבדה שלנו, בשנת 2011, Prados-Rosales ועמיתיו דיווחו לראשונה על הדמיה והעשרה של mEV במבחנה30. מאוחר יותר, בשנת 2014, אותה קבוצה פרסמה גרסה שונה של שיטת2011 34. בשנת 2015, Lee et al. דיווחו גם על שיטה סטנדרטית עצמאית להעשרת mEV שוב מתרביות אקסניות של מיקובקטריה35. בשילוב שני הפרוטוקולים34,35 ושילוב כמה מהשינויים שלנו לאחר סטנדרטיזציה יסודית, אנו מתארים כאן פרוטוקול המסייע להעשיר באופן שגרתי mEV מתרביות אקסניות של מיקובקטריה 36.
כאן אנו מפרטים במיוחד את ההעשרה של כלי רכב חשמליים ספציפיים ל-Msm, שהיא הרחבה של פרוטוקול36 שפורסם להעשרת רכבים חשמליים מיקובקטריאליים בכלל. אנו גם מפרטים כיצד לבנות mEV רקומביננטי (R-mEVs) המכילים את חלבון mCherry (ככתב פלואורסצנטי אדום) ואת EsxA (Esat-6)37,38,39, אימונוגן דומיננטי ותת-יחידה פוטנציאלית מחוסנת של Mycobacterium tuberculosis. הפרוטוקול להעשרת ה-R-mEV נותר זהה לזה שתיארנו להעשרת כלי רכב חשמליים מקומיים מ-Msm.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאחר שפיתוח חיסון חדשני לשחפת שעדיף על BCG ויכול להחליף אותו נותר אתגר עצום, כחלופה, מספר קבוצות מחפשות גילוי של חיסוני שחפת תת-יחידות שונות שיכולים להגביר את עוצמתו של BCG ולהאריך את משך ההגנה שלו48,49. בהתחשב בתשומת הלב הגוברת לרכבים חשמליים חיידקיים (bEVs) כתת-יח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים מקרב לב לפרופ’ שרה מ. פורצ’ן על שיתוף המניות של M. smegmatis mc2155. הם גם מכירים ב-Servier Medical Art (smart.servier.com) על כך שהוא מספק כמה אלמנטים בסיסיים עבור איור 1. הם מודים בכנות על תמיכתם של שאר חברי המעבדה בהתאמות המטופלים שלהם במהלך השימוש הממושך בשייקרים של האינקובטור, הצנטריפוגות והאולטרה-צנטריפוגות להעשרת mEV. הם גם מודים למר סורג’יט יאדאב, עוזר המעבדה, על כך שתמיד דאג שכלי הזכוכית והחומרים המתכלים הדרושים יהיו תמיד זמינים ושימושיים. לבסוף, הם מודים לצוותי הניהול, הרכישה והכספים של THSTI על תמיכתם המתמדת ועזרתם בביצוע חלק של הפרויקט.
Materials
| A2 type Biosafety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, USA | 1300 series | |
| Bench top Centrifuge | Eppendorf, USA | 5810 R | |
| BstB1, HindIII, HpaI | NEB, USA | NEB | |
| Cell densitometer | GE Healthcare, USA | Ultraspec 10 | |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Dibasic Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Double Distilled Water | Merck, USA | ~18.2 MW/cm @ 25 oC | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad, USA | 2 mm | |
| Electroporator | Bio-Rad, USA | Electroporator | |
| EsxA-specific Ab | Abcam, UK | Rabbit polyclonal | |
| Ferric Ammonium Citrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Floor model centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | Sorvall RC6 plus | |
| Glassware | Borosil, INDIA | 1 L Erlenmeyer flasks | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| HEPES and Sodium Chloride | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Incubator shakers | Thermo Fisher Scientific, USA | MaxQ 6000 & 8000 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Luria Bertani Broth and Agar, Miller | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Magnetic stirrer | Tarsons, INDIA | Tarsons | |
| mCherry-specific Ab | Abcam, UK | Rabbit monoclonal | |
| Microwave | LG, INDIA | MC3286BLT | |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD, USA | Difco Middlebrook 7H9 Broth | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD, USA | BBL Middlebrook ADC enrichment | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, USA | Spectronic 200 UV-Vis | |
| NEB5a | NEB, USA | a derivative of DH5a | |
| Optiprep (Iodixanol) | Merck, USA | Available as 60% stock solution (in water) | |
| PCR purification kit | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
| pH Meter | Mettler Toledo, USA | Mettler Toledo | |
| Plasmid DNA mini kit | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
| Plate incubator | Thermo Fisher Scientific, USA | New Series | |
| Plasmid pMV261 | Addgene, USA * *The plasmid is no more available in this plasmid bank |
Shuttle vector | |
| Proof-reading DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific, USA | Phusion DNA Plus Polymerase | |
| Q5 Proof-reading DNA Polymerase | NEB, USA | NEB | |
| Refrigerated circulating water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | R20 | |
| Middlebrock 7H11 Agar base | BD, USA | BBL Seven H11 Agar base | |
| SOC broth | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| T4 DNA Ligase | NEB, USA | NEB | |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, USA | Optima L100K | |
| Ultracentrifuge tubes – 14 mL | Beckman Coulter, USA | Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes – 38 mL | Beckman Coulter, USA | Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor | |
| Ultrasonics cleaning waterbath sonicator | Thermo Fisher Scientific, USA | Sonicator – bench top model | |
| 0.22 µm Disposable filters | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
| 30-kDa Centricon concentrators | Merck, USA | Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore | |
| 3X FLAG antibody | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| 400 mL Centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Corning, USA | Sterile, pre-packed | |
| Bacteria | |||
| Strain | |||
| Escherichia coli | NEB, USA | NEB 5-alpha (a derivative of DH5α). | |
| Msm expressing cfp29::mCherry | This study | MC2 155 | |
| Msm expressing cfp29::esxA | This study | MC2 155 | |
| Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG | This study | MC2 155 | |
| Mycobacterium smegmatis (Msm) | Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA | MC2 155 |
References
- . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
- Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
- Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
- Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
- Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG – implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
- Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
- Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
- Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
- Dietrich, G., Viret, J. -. F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
- Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
- Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
- Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
- Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
- Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
- Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
- Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
- Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
- Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
- Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
- Lee, W. -. H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
- Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
- Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
- Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
- Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
- Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
- Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
- Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
- Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
- Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
- Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium – Research and Development. IntechOpen. , (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
- Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
- Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -. N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
- Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
- Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
- Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
- Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
- Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , (2012).
- Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
- Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
- Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
- Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
- Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).
