Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Bulaşıcı hastalıklara karşı çok çeşitli aşıların geliştirilmesine ve uygulanmasına rağmen, bugüne kadar bile, tüm insan ölümlerinin ~%30’u hala bulaşıcı hastalıklardan kaynaklanmaktadır¹. Tüberküloz (TB) aşısının ortaya çıkmasından önce – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – TB bir numaralı katildi (~10.000 ila 15.000 / 100.000 nüfus)². BCG’nin uygulanması ve birinci ve ikinci basamak anti-TB ilaçlarına kolay erişim ile 2022 yılına kadar, TB’ye bağlı ölümler 2022 yılına kadar ~1 milyon/yıl’a önemli ölçüde düşmüştür (yani, ~15-20/100.000 nüfus¹). Bununla birlikte, dünyanın TB endemik popülasyonlarında, TB’ye bağlı ölümler ~ 100-550 / 100.000 nüfusta^durmaya devam etmektedir 1. Uzmanlar bu çarpık sayılara yol açan çeşitli nedenleri kabul ederken, BCG aracılı korumanın yaşamın ilk on yılında bile sürmemesi^öne çıkan neden gibi görünmektedir 3,4,5,6,7. Sonuç olarak, BM’nin yenilenen ‘Sürdürülebilir Kalkınma Hedefleri’ ve DSÖ’nün ‘Tüberkülozu Bitirme Stratejisi’ göz önüne alındığında, belki de tüberkülozdan ömür boyu koruma sağlayan BCG’ye çok daha üstün bir aşı alternatifi geliştirmek için ortak bir küresel çaba var.

Bu amaca yönelik olarak, şu anda birkaç grup modifiye / rekombinant BCG suşlarını, BCG dışındaki patojenik olmayan ve zayıflatılmış mikobakteriyel türleri ve alt birim adaylarını^{değerlendirmektedir} 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Tipik olarak, alt birim aşılar, patojenin birkaç saflaştırılmış (~ 1-6) tam uzunlukta veya kesilmiş immünojenik proteini ile seçici olarak yüklenmiş lipozomlardır. Bununla birlikte, doğal olmayan konformasyonlara sahte katlanmaları ve/veya yüklü proteinler arasındaki rastgele işlevsel olmayan etkileşimler nedeniyle, alt birimler genellikle doğal ve germane epitoplarından yoksundur ve bu nedenle bağışıklık sistemini yeterince hazırlayamaz^14,19,20.

Sonuç olarak, bakterilerin hücre dışı vezikülleri (EV’ler) umut verici bir alternatif olarak hız kazanmıştır 21,22,23,24,25,26. Tipik olarak, bakteriyel EV’ler (bEV’ler), nükleik asitlerin, lipitlerin ve yüzlerce metabolit ve proteinin bazı kısımları dahil olmak üzere hücresel bileşenlerinin bir alt kümesini içerir^27,28. Birkaç saflaştırılmış proteinin yapay olarak yüklendiği lipozomların aksine, bEV’ler, özellikle adjuvanların ve Toll benzeri reseptör (TLR) agonistlerinin desteği/yardımı olmadan, bağışıklık sistemini hazırlamak için daha iyi bir eğilime sahip, doğal olarak yüklenmiş, doğal olarak katlanmış yüzlerce protein içerir^27,28,29. Bu araştırma hattında, biz ve diğerleri, mikobakteriyel EV’lerin BCG^30’a potansiyel alt birim güçlendiriciler olarak faydasını araştırdık. bEV’lerin tek tip antijen yüklerinden yoksun olduğuna dair endişelere rağmen, zayıflatılmış Neisseria meningitidis’ten elde edilen EV’ler, insanları serogrup B meningokoklarına karşı başarıyla korumuştur^31,32.

En azından teorik olarak, BCG’yi iyi bir şekilde artırabilecek en iyi EV’ler, patojenik bakterilerden zenginleştirilmiş EV’lerdir. Bununla birlikte, patojenik mikobakteri tarafından üretilen EV’leri zenginleştirmek pahalı, zaman alıcı ve risklidir. Ek olarak, patojen kaynaklı EV’ler koruyucu olmaktan çok öldürücü olabilir. Potansiyel riskler göz önüne alındığında, burada, avirulan bir mikobakteri olan aksenik olarak yetiştirilen Msm tarafından üretilen EV’lerin zenginleştirilmesi için iyi test edilmiş bir protokol bildiriyoruz.

Bununla birlikte, birkaç patojen protein ortologunu kodlamasına rağmen, avirulent mikobakteriler, bağışıklık sistemini korumaya yeterince hazırlamak için gerekli olan birkaç aşı antijeni/patojenik protein epitopundan yoksundur³³. Bu nedenle, moleküler mühendislik yoluyla Msm’nin rekombinant EV’lerini oluşturmayı ve zenginleştirmeyi de araştırdık, öyle ki Msm’de ifade edilen ve çevrilen herhangi bir patojenik proteinin önemli bir kısmı EV’lerine ulaşmalıdır. Msm EV’lerin en bol bulunan 10 proteininden bir veya daha fazlasının, ilgilenilen proteine kaynaştığında bu tür bir translokasyona yardımcı olacağını varsaydık.

Laboratuvarımızda mikobakteriyel EV’lerin (mEV’ler) zenginleştirilmesini standartlaştırmaya başlarken, 2011 yılında Prados-Rosales ve ark. ilk olarak mEV’lerin in vitro^30’un görselleştirilmesini ve zenginleştirilmesini bildirdi. Daha sonra, 2014 yılında, aynı grup 2011 yöntem^34’ün değiştirilmiş bir versiyonunu yayınladı. 2015 yılında, Lee ve ark. ayrıca mikobakterilerin³⁵ aksenik kültürlerinden mEV zenginleştirme için bağımsız olarak standartlaştırılmış bir yöntem bildirdiler. Her iki protokolü^{de 34,35} birleştirerek ve kapsamlı standardizasyondan sonra modifikasyonlarımızdan birkaçını dahil ederek^, burada mikobakterilerin ³⁶ aksenik kültürlerinden mEV’leri rutin olarak zenginleştirmeye yardımcı olan bir protokolü açıklıyoruz.

Burada, genel olarak mikobakteriyel EV’lerin zenginleştirilmesi için yayınlanmış bir protokol^36’nın bir uzantısı olan Msm’ye özgü EV’lerin zenginleştirilmesini özellikle detaylandırıyoruz. Ayrıca, mCherry proteinini (kırmızı floresan raportör olarak) ve EsxA’yı (Esat-6)^37,38,39, baskın bir immünojen ve Mycobacterium tuberculosis’in potansiyel bir alt birim aşılayıcısı olarak içeren rekombinant mEV’lerin (R-mEV’ler) nasıl oluşturulacağını da detaylandırıyoruz. R-mEV’leri zenginleştirme protokolü, Msm’den yerel EV’leri zenginleştirmek için tanımladığımız protokolle aynı kalır.