Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

A pesar del desarrollo y la administración de una amplia gama de vacunas contra enfermedades infecciosas, incluso hasta el día de hoy, ~ 30% de todas las muertes humanas todavía ocurren por enfermedades transmisibles¹. Antes de la llegada de la vacuna contra la tuberculosis (TB) – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – la tuberculosis era la principal causa de muerte (~10.000 a 15.000/100.000 habitantes)². Con la administración de BCG y el fácil acceso a medicamentos antituberculosos de primera y segunda línea, para 2022, las muertes relacionadas con la tuberculosis se han reducido drásticamente a ~ 1 millón/año para 2022 (es decir, ~ 15-20/100,000 habitantes¹). Sin embargo, en las poblaciones endémicas de tuberculosis del mundo, las muertes relacionadas con la tuberculosis siguen siendo de ~100-550/100.000 habitantes¹. Si bien los expertos reconocen varias razones que conducen a estos números sesgados, la protección mediada por BCG que no dura ni siquiera la primera década de vida parece ser la razón principal 3,4,5,6,7. En consecuencia, dados los renovados “Objetivos de Desarrollo Sostenible” de las Naciones Unidas y la “Estrategia para poner fin a la tuberculosis” de la OMS, existe un esfuerzo mundial concertado para desarrollar una vacuna alternativa muy superior a la BCG que tal vez proporcione protección de por vida contra la tuberculosis.

Con ese objetivo, varios grupos están evaluando actualmente cepas de BCG modificadas/recombinantes, especies micobacterianas no patógenas y atenuadas distintas de BCG, y candidatos a subunidades 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por lo general, las vacunas de subunidades son liposomas cargados selectivamente con pocas proteínas inmunogénicas purificadas (~ 1-6) de longitud completa o truncadas del patógeno. Sin embargo, debido a su plegamiento espurio en conformaciones no nativas y/o interacciones aleatorias no funcionales entre las proteínas cargadas, las subunidades a menudo carecen de epítopos nativos y pertinentes y, por lo tanto, no preparan suficientemente el sistema inmune^14,19,20.

En consecuencia, las vesículas extracelulares (VE) de las bacterias se han acelerado como una alternativa prometedora 21,22,23,24,25,26. Por lo general, los VE bacterianos (bEV) contienen un subconjunto de sus componentes celulares, incluidas algunas porciones de ácidos nucleicos, lípidos y cientos de metabolitos y proteínas^27,28. A diferencia de los liposomas en los que unas pocas proteínas purificadas se cargan artificialmente, los bEV contienen cientos de proteínas cargadas de forma natural y plegadas de forma nativa con una mejor propensión a preparar el sistema inmunitario, especialmente sin el refuerzo/ayuda de adyuvantes y agonistas del receptor tipo Toll (TLR)^27,28,29. Es en esta línea de investigación que nosotros y otros hemos explorado la utilidad de los VE micobacterianos como posibles potenciadores de subunidades para BCG³⁰. A pesar de la preocupación de que los BVE carezcan de cargas antigénicas uniformes, los VE de Neisseria meningitidis atenuada han protegido con éxito a los seres humanos contra el meningococo del serogrupo B^31,32.

Al menos teóricamente, los mejores VE que podrían impulsar bien la BCG son los VE enriquecidos a partir de bacterias patógenas. Sin embargo, el enriquecimiento de los VE generados por micobacterias patógenas es costoso, requiere mucho tiempo y es arriesgado. Además, los vehículos eléctricos generados por patógenos pueden ser más virulentos que protectores. Dados los riesgos potenciales, aquí informamos de un protocolo bien probado para el enriquecimiento de los VE generados por Msm, una micobacteria avirulenta cultivada axénicamente.

Sin embargo, a pesar de codificar varios ortólogos de proteínas patógenas, las micobacterias avirulentas carecen de varios antígenos vacunales/epítopos de proteínas patógenas necesarios para preparar suficientemente al sistema inmunitario hacia la protección³³. Por lo tanto, también exploramos la construcción y el enriquecimiento de EV recombinantes de Msm a través de la ingeniería molecular, de modo que una parte significativa de cualquier proteína patógena de interés expresada y traducida en Msm, debe llegar a sus EV. Planteamos la hipótesis de que una o más de las 10 proteínas más abundantes de los EV de MSM, cuando se fusionan con la proteína de interés, ayudarán en dicha translocación.

Cuando estábamos empezando a estandarizar el enriquecimiento de las VE micobacterianas (mEVs) en nuestro laboratorio, en 2011, Prados-Rosales et al. reportaron por primera vez la visualización y enriquecimiento de las mEVs in vitro³⁰. Más tarde, en 2014, el mismo grupo publicó una versión modificada de su método³⁴ de 2011. En 2015, Lee et al. también informaron de un método estandarizado de forma independiente para el enriquecimiento de mEV a partir de cultivos axénicos de micobacterias³⁵. Combinando ambos protocolos^34,35 e incorporando algunas de nuestras modificaciones después de una estandarización exhaustiva^, describimos aquí un protocolo que ayuda a enriquecer rutinariamente los mEV de cultivos axénicos de micobacterias ³⁶.

Aquí, detallamos particularmente el enriquecimiento de los VE específicos de Msm, que es una extensión de un protocolo publicado³⁶ para el enriquecimiento de los VE micobacterianos en general. También detallamos cómo construir mEVs recombinantes (R-mEVs) que contienen la proteína mCherry (como un reportero fluorescente rojo) y EsxA (Esat-6)^37,38,39, un inmunógeno predominante y una potencial subunidad vaccinógena de Mycobacterium tuberculosis. El protocolo para enriquecer los R-mEVs sigue siendo idéntico al que hemos descrito para enriquecer los EVs nativos a partir de Msm.