Enrichissement des vésicules extracellulaires natives et recombinantes de mycobactéries

Malgré le développement et l’administration d’une large gamme de vaccins contre les maladies infectieuses, encore aujourd’hui, ~30 % de tous les décès humains sont dus à des maladies transmissibles¹. Avant l’avènement du vaccin antituberculeux (TB) – Bacillus Calmette Guérin (BCG) – la tuberculose était la première cause de mortalité (~10 000 à 15 000/100 000 habitants)². Grâce à l’administration du BCG et à l’accès facile aux médicaments antituberculeux de première et de deuxième intention, en 2022, le nombre de décès liés à la tuberculose a considérablement chuté à ~1 million/an en 2022 (c’est-à-dire ~15-20/100 000 habitants¹). Cependant, dans les populations endémiques de tuberculose dans le monde, les décès liés à la tuberculose continuent de se situer entre ~100 et 550/100 000 habitants¹. Bien que les experts reconnaissent plusieurs raisons conduisant à ces chiffres faussés, la protection médiée par le BCG ne dure même pas pendant la première décennie de la vie semble être la principale raison 3,4,5,6,7. Par conséquent, compte tenu des « Objectifs de développement durable » renouvelés de l’ONU et de la « Stratégie pour mettre fin à la tuberculose » de l’OMS, il y a un effort mondial concerté pour développer une alternative vaccinale bien supérieure au BCG qui offre peut-être une protection à vie contre la tuberculose.

Pour atteindre cet objectif, plusieurs groupes évaluent actuellement des souches modifiées/recombinantes du BCG, des espèces mycobactériennes non pathogènes et atténuées autres que le BCG, et des sous-unités candidates 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . En règle générale, les vaccins sous-unitaires sont des liposomes chargés sélectivement avec peu de protéines immunogènes purifiées (~1-6) de longueur complète ou tronquée de l’agent pathogène. Cependant, en raison de leur repliement parasite en conformations non natives et/ou d’interactions aléatoires non fonctionnelles entre les protéines chargées, les sous-unités manquent souvent d’épitopes natifs et germaniques et, par conséquent, ne parviennent pas à amorcer suffisamment le système immunitaire^14,19,20.

Par conséquent, les vésicules extracellulaires (VE) des bactéries ont pris de l’ampleur en tant qu’alternative prometteuse 21,22,23,24,25,26. En règle générale, les VE bactériennes (bEV) contiennent un sous-ensemble de leurs composants cellulaires, y compris certaines portions d’acides nucléiques, de lipides et des centaines de métabolites et de protéines^27,28. Contrairement aux liposomes où quelques protéines purifiées sont chargées artificiellement, les bEV contiennent des centaines de protéines naturellement chargées, repliées nativement, avec une meilleure propension à amorcer le système immunitaire, en particulier sans le coup de pouce / l’aide d’adjuvants et d’agonistes des récepteurs de type Toll (TLR)^27,28,29. C’est dans cette ligne de recherche que nous et d’autres avons exploré l’utilité des VE mycobactériennes en tant que boosters potentiels de sous-unités du BCG³⁰. Malgré les inquiétudes selon lesquelles les bEV n’ont pas de charges antigéniques uniformes, les VE de Neisseria meningitidis atténué ont réussi à protéger les humains contre le méningocoque du sérogroupe^{B 31,32}.

Du moins en théorie, les meilleurs VE qui pourraient bien booster le BCG sont les VE enrichis en bactéries pathogènes. Cependant, l’enrichissement des VE générées par des mycobactéries pathogènes est coûteux, long et risqué. De plus, les VE générées par des agents pathogènes peuvent être plus virulentes que protectrices. Compte tenu des risques potentiels, nous rapportons ici un protocole bien testé pour l’enrichissement des VE générées par le Msm cultivé axéniquement, une mycobactérie avirulente.

Cependant, bien qu’elles codent pour plusieurs orthologues de protéines pathogènes, les mycobactéries avirulentes manquent de plusieurs antigènes vaccinaux/épitopes protéiques pathogènes nécessaires pour préparer suffisamment le système immunitaire à la protection³³. Par conséquent, nous avons également exploré la construction et l’enrichissement des VE recombinantes de Msm par ingénierie moléculaire, de sorte qu’une partie importante de toute protéine pathogène d’intérêt exprimée et traduite en Msm, doit atteindre ses EV. Nous avons émis l’hypothèse qu’une ou plusieurs des 10 protéines les plus abondantes des VE Msm, lorsqu’elles sont fusionnées à la protéine d’intérêt, aideront à une telle translocation.

Alors que nous commencions à standardiser l’enrichissement des VE mycobactériennes (mEVs) dans notre laboratoire, en 2011, Prados-Rosales et al. ont rapporté pour la première fois la visualisation et l’enrichissement des mEVs in vitro³⁰. Plus tard, en 2014, le même groupe a publié une version modifiée de sa méthode³⁴ de 2011. En 2015, Lee et al. ont également fait état d’une méthode standardisée indépendante pour l’enrichissement en mEV à partir de cultures axéniques de mycobactéries³⁵. En combinant les deux protocoles^34,35 et en incorporant quelques-unes de nos modifications après une standardisation approfondie^, nous décrivons ici un protocole qui permet d’enrichir régulièrement les mEVs à partir de cultures axéniques de mycobactéries ³⁶.

Ici, nous détaillons particulièrement l’enrichissement des VE spécifiques au MSM, qui est une extension d’un protocole publié³⁶ pour l’enrichissement des VE mycobactériennes en général. Nous détaillons également comment construire des mEVs recombinants (R-mEVs) qui contiennent la protéine mCherry (en tant que rapporteur fluorescent rouge) et EsxA (Esat-6)^37,38,39, un immunogène prédominant et une sous-unité potentielle de vaccinogène de Mycobacterium tuberculosis. Le protocole d’enrichissement des R-mEVs reste identique à celui que nous avons décrit pour l’enrichissement des VE natifs à partir de Msm.