Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

Le cellule percepiscono attivamente e rispondono agli stimoli meccanici. In tal modo, molte biomolecole mostrano proprietà dipendenti dalla forza che consentono cambiamenti strutturali dinamici. Esempi ben apprezzati includono canali ionici meccanosensibili ed elementi citoscheletrici che forniscono alle cellule informazioni meccaniche chiave dall’ambiente circostante.

Inoltre, le molecole che mostrano una natura portante unica possono anche essere considerate meccanosensibili in un senso più ampio. Ad esempio, la formazione locale e la fusione di duplex di acidi nucleici, così come strutture di ordine superiore come i G-quadruplex, svolgono ruoli cruciali nella replicazione, nella trascrizione, nella ricombinazione e, più recentemente, nell’editing del genoma. Inoltre, alcune proteine neuronali coinvolte nelle comunicazioni sinaptiche svolgono le loro funzioni generando forze fisiche che superano i livelli delle tipiche interazioni intermolecolari. Indipendentemente dall’esempio studiato, lo studio della nanomeccanica delle biomolecole coinvolte con elevata precisione spaziotemporale si rivelerà molto utile per rivelare i meccanismi molecolari dei processi meccanobiologici associati ^1,2,3.

I metodi di spettroscopia di forza a singola molecola sono serviti come potenti strumenti per esaminare le proprietà meccaniche delle biomolecole 2,4,5,6. Possono monitorare i cambiamenti strutturali negli acidi nucleici e nelle proteine in concomitanza con l’applicazione della forza, esaminando così le proprietà dipendenti dalla forza. Due configurazioni ben note sono le pinzette ottiche e le pinzette magnetiche (MT), che impiegano perline di dimensioni micron per manipolare le molecole 5,6,7,8. In queste piattaforme, il polistirene (per le pinzette ottiche) o le perle magnetiche (per le MT) sono legati alle molecole bersaglio (ad esempio, acidi nucleici e proteine) tramite “maniglie” molecolari, tipicamente costituite da brevi frammenti di DNA a doppio filamento (dsDNA). Le perle vengono quindi spostate per esercitare forza e visualizzate per tracciare le loro posizioni che riportano i cambiamenti strutturali nelle molecole bersaglio. Le pinzette ottiche e magnetiche sono in gran parte intercambiabili nelle loro applicazioni, ma esistono importanti differenze nei loro approcci al controllo della forza. Le pinzette ottiche sono strumenti intrinsecamente posizionati che intrappolano le perline in posizione, a causa delle quali la forza applicata fluttua quando un costrutto bersaglio subisce cambiamenti di forma; L’aumento dell’estensione, ad esempio dall’apertura, allenta il cavo e riduce la tensione e viceversa. Sebbene il feedback attivo possa essere implementato per controllare la forza nelle pinzette ottiche, gli MT al contrario funzionano naturalmente come un dispositivo di morsetto, sfruttando le forze magnetiche stabili e a campo lontano da magneti permanenti, che possono anche resistere alle perturbazioni ambientali.

Nonostante la loro lunga storia e il design semplice, le MT sono rimaste indietro rispetto alle pinzette ottiche nelle loro applicazioni a misurazioni ad alta precisione, in gran parte a causa delle sfide tecniche nel tracciamento rapido delle perline. Recentemente, tuttavia, diversi gruppi hanno condotto congiuntamente un miglioramento multiforme sia dell’hardware che del software per gli strumenti MT 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . In questo lavoro, presentiamo un esempio di tale configurazione in esecuzione a 1,2 kHz e descriviamo come usarla per eseguire misurazioni nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza. Come sistemi modello, utilizziamo forcine di DNA e complessi SNARE neuronali ed esaminiamo i loro rapidi cambiamenti strutturali nel regime di Piconewton. Le forcine per capelli in DNA mostrano semplici transizioni a due stati in un intervallo di forza ben definito^20,21, e quindi servono come modelli giocattolo per verificare le prestazioni di una configurazione pinzetta. Poiché le proteine SNARE si assemblano in un complesso sensibile alla forza che guida la fusione di membrana²², sono state anche ampiamente studiate mediante spettroscopia di forza a singola molecola 14,23,24,25. Vengono presentati approcci standard per l’analisi dei dati e l’estrazione di informazioni utili sulla termodinamica e sulla cinetica. Speriamo che questo articolo possa facilitare l’adozione di MT ad alta precisione negli studi meccanobiologici e motivare i lettori a esplorare i propri sistemi di interesse sensibili alla forza.