JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

הקלה על דלקת מפרקים ניוונית בעכברים באמצעות ננו-חלקיקי כסף

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/65111
, , , , , , , ,
1Department of Orthopedics,The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לשימוש בננו-חלקיקי כסף כדי להקל ביעילות על הסימפטומים החריפים של עכברי אוסטיאוארתריטיס הנגרמים על ידי קולגנאז מסוג II, כולל דלקת סינוביאלית, היפרפלזיה סינוביאלית, היפרפלזיה וסקולרית וכו ‘.

Abstract

דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA) היא אחת המחלות הניווניות הנפוצות ביותר של המפרקים אצל אנשים מעל גיל 45. נכון לעכשיו, אין טיפולים יעילים עבור KOA, והאסטרטגיה היחידה של נקודת הקצה היא ארתרופלסטיקה כוללת של הברך (TKA); לכן, KOA קשורה לנטל כלכלי ועלויות חברתיות. התגובה הדלקתית החיסונית מעורבת בהתרחשות ופיתוח של KOA. בעבר הקמנו מודל עכברי של KOA תוך שימוש בקולגן מסוג II. היפרפלזיה של הרקמה הסינוביאלית נמצאה במודל, לצד מספר רב של תאי דלקת שהסתננו. לננו-חלקיקי כסף יש השפעות אנטי דלקתיות משמעותיות והם נמצאים בשימוש נרחב בטיפול בגידולים ובמתן תרופות כירורגיות. לכן, הערכנו את ההשפעות הטיפוליות של ננו-חלקיקי כסף במודל KOA המושרה על ידי collagenase II. תוצאות הניסוי הראו כי חלקיקי כסף הפחיתו באופן משמעותי את ההיפרפלזיה הסינוביאלית ואת חדירת הנויטרופילים לרקמה הסינוביאלית. לפיכך, עבודה זו מדגימה זיהוי של אסטרטגיה חדשה עבור OA ומספקת בסיס תיאורטי למניעת התקדמות KOA.

Introduction

דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA) היא אחת הצורות השכיחות ביותר של דלקת מפרקים ניוונית וכוללת תהליך מחלה מורכב בכל המפרק הסינוביאלי1. ככל שאוכלוסיית העולם מזדקנת בהדרגה, שכיחות KOA עולה באופן משמעותי. כאב עקבי במפרק הברך בדרך כלל גורם לחולים עם KOA לפנות לטיפול רפואי. האטיולוגיה של הכאב ב- KOA עשויה להיות קשורה לתגובה דלקתית, היפרפלזיה סינוביאלית וניוון סחוס2. רקמות הסינוביום מורכבות משני סוגי תאים: פיברובלסטים סינוביאליים ומקרופאגים 3,4,5. פיברובלסטים סינוביאליים מייצרים נוזל סינוביאלי. מקרופאגים סינוביאליים הם בדרך כלל רדומים ומופעלים על ידי התגובה הדלקתית. דלקת ראשונית של סינוביום גורמת לכאבי מפרקי ברכיים6.

התגובה החיסונית הדלקתית של רקמת סינוביום ממלאת תפקיד מכריע בפתוגנזה של KOA. מחקרים קודמים אישרו כי ישנן תגובות דלקתיות ברקמות סינוביום ב- KOA, הידועות בשם סינוביטיס, ודרגת הסינוביטיס של KOA קשורה קשר הדוק לחדירת תאים דלקתיים של רקמות סינוביום 7,8,9. סינוביטיס היא תגובה דלקתית של הסינוביום, ומאפייניה הפתולוגיים הם התפשטות תאים סינוביאליים, היווצרות כלי דם חדשים וחדירת תאים דלקתיים 5,10,11.

מטרת הטיפול ב- KOA היא להקל על התגובה הדלקתית של הסינוביום ולעכב את התקדמות המחלה. כיום, התרופות הקליניות העיקריות לטיפול ב- KOA הן תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs); עם זאת, הם מציגים תופעות לוואי משמעותיות, כגון nephrotoxicity 12,13. זריקות גלוקוקורטיקואידים תוך מפרקיים הן אפשרות נוספת לטיפול ב- KOA; עם זאת, glucocorticoid מתפשט במהירות יכול להיות מטבוליזם במהירות על ידי השתפכות המפרק. בינתיים, חולי סוכרת עם היפרגליקמיה בסיסית צריכים להיות זהירים לגבי זריקות סטרואידים מתמשכות14. לסיכום, אין אסטרטגיה טיפולית תרופתית זמינה עבור KOA. לכן, החיפוש של תרופות חדשות לטיפול KOA הוא דחוף ביותר.

גודלם של ננו-חלקיקי כסף קטן מ-100 ננומטר. בשל ההשפעות האנטי-דלקתיות, האנטי-בקטריאליות ונוגדות החמצון הבולטות שלהם, נעשה בהם שימוש נרחב בהיבטים שונים של בריאות ורפואה, כגון ריפוי פצעים ופציעות כוויות15,16. הם משמשים גם במתן תרופות ממוקדות, הדמיה רפואית ואבחון מולקולרי17. לכסף (Ag) יש פעילות אנטי דלקתית ואנטי-בקטריאלית גדולה יותר מאשר ננו-חלקיקי מתכת אחרים, כגון נחושת (Cu), אבץ (Zn) וברזל (Fe)15. ננו-חלקיקי כסף, סוג חדש של ננו-חומר, הם בעלי ספקטרום רחב ותכונות אנטי-מיקרוביאליות חזקות. מחקר קודם מצא כי במודלים של פציעות כוויות ודלקת הצפק 18,19, ננו-חלקיקי כסף יכולים לעכב ביעילות את הייצור של גורמים דלקתיים ולקדם ריפוי פצעים. מחקר קודם הראה גם כי ננו-חלקיקי כסף שיפרו את ריפוי פצעי הסוכרת על ידי קידום הסינתזה של גורמי גדילה ושקיעת קולגן20.

בהתבסס על ההשפעות האנטי-דלקתיות של ננו-חלקיקי כסף, מטרתנו הייתה להשתמש בננו-חלקיקי כסף לטיפול ב-KOA המושרה על-ידי קולגן מסוג II בעכברים. התוצאות הצביעו על כך שמספר תאי ההסננה הדלקתיים של המפרק הסינוביאלי בעכברים הופחת משמעותית עם טיפול זה. התוצאות גם הצביעו על כך שננו-חלקיקי כסף יכולים להקל באופן משמעותי על הסימפטומים של KOA בעכברים. לכן, היישום של חלקיקי כסף עשוי לתמוך בפיתוח אפשרויות טיפול חדשות עבור KOA קליני.

Protocol

כל עבודת בעלי החיים אושרה על ידי הוועדה לאתיקה ורווחה של בעלי חיים (AEWC) של מרכז בעלי החיים במעבדה רפואית גואנגזו לנצח (2018-0186). 1. הקמת מודל עכבר KOA יש לשמור על עכברי BALB/c (18-24 גרם; בני 12-14 שבועות) בסביבה עם 70% לחות ובטמפרטורה של 26°C עם מחזור בהיר/כהה של 12 שעות. לצורך ניסוי זה, בעלי החיים נשמרו במרכז בעלי החיים של המעבדה הרפואית גואנגזו פורברגן. השתמש בקולגן מסוג II כדי ליצור מודל עכבר KOA כפי שתואר קודם לכן21. בצע את ההזרקה התוך מפרקית כמתואר להלן.יש למרוח 2% נתרן פנטוברביטל (40 מ”ג/ק”ג) להרדמה ובופרנורפין (0.05 מ”ג/ק”ג, הזרקה תת-עורית) לשיכוך כאבים. לאחר מכן, לתקן את איברי העכבר עם הקלטת, להסיר את השיער עם סכין גילוח, ולחטא עם פילינג לסירוגין של 0.1% יודופור ואלכוהול שלוש פעמים. יש ללבוש כפפות סטריליות ולהשתמש במספריים סטריליים כדי לחשוף ברצף את העור, הרקמה התת עורית והרצועה האינפרא-פטלרית. יש לשמור על אזור חתך מתחת ל-0.5 ס”מ.הערה: שמיכת חימום שימשה לשמירה על טמפרטורת הגוף של העכברים במהלך הניתוח. השתמש מזרק אינסולין 1 מ”ל כדי להזריק 10 U של 30 מ”ג / ק”ג (0.4 מ”ג / מ”ל) סוג II collagenase לתוך חלל המפרק (מתחת הרצועה infrapatellar)22.הערה: הזווית בין המחט לעור צריכה להיות כ-15°; לאחר מכן, יש לשנות את כיוון המחט, ויש למשוך את המחט לחלוטין. לאחר ההזרקה, לתפור תחילה את הרקמה התת עורית, ולאחר מכן את העור. לעקר את אזור התפר עם יודופור 0.1%. הכניסו את העכברים לכלובים המאווררים בנפרד לאחר שהם מתעוררים מההרדמה. 2. סינתזה של חלקיקי כסף הערה: הכנת ננו-חלקיקי כסף תוארה בעבר בפירוט19. כל תהליך הניסוח מתבצע על קרח. לאחר ההכנה, התערובת מאוחסנת ב 4 °C (75 °F); אחרת, התערובת מתמצקת בקלות בטמפרטורת החדר. הוסף סך של 400 μL של קולגן מסוג I (4 מ”ג / מ”ל) לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ”ל, ומניחים על קרח. הוסיפו לקולגן הנ”ל סך של 200 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS), ערבבו היטב את התמיסה והניחו אותה על קרח. לבסוף, הוסף 400 μL של ננו-חלקיקי כסף לתמיסה לעיל, ולאחר מכן לערבב מספיק. הריכוז הסופי של תמיסת הננו-חלקיקים הוא 1 מילימול.הערה: הקוטר הממוצע של ננו-חלקיקי הכסף נע בין 5 ננומטר ל-15 ננומטר23. זה אושר על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. 3. טיפול בננו-חלקיקי כסף בעכברי KOA מסוג II המושרה על ידי collagenase הסר את עכברי KOA מסוג II המושרה על ידי collagenase מהכלובים שלהם שבוע לאחר מכן, והזריק להם ננו-חלקיקי כסף. הזריקו את חלקיקי הכסף פעם בשבוע, ואספו את הדגימות 30 יום לאחר מכן. יש להזריק סך של 2% נתרן פנטוברביטל (מינון: 2 מ”ל/ק”ג) להרדמה באמצעות הזרקה תוך צפקית, ולאחר מכן לתקן, להכין את העור ולעקר כמתואר בשלבים 1.2. יש ללבוש כפפות סטריליות ולהשתמש במספריים סטריליים כדי לחשוף ברצף את העור, הרקמה התת עורית ורצועות הברך. השתמש מזרק אינסולין 1 מ”ל, ולהיכנס לחלל המפרק בזווית של 15 מעלות עם המחט. הזריקו באיטיות כ-20 מיקרוליטר מתערובת הקולגן הננו-חלקיקי הכסופה, ומשכו לאט את המחט24. לתפור את הרקמה התת עורית ואת העור בתורו, ולעקר. הכניסו את העכברים לכלובים מאווררים בנפרד (IVC) לאחר שהם מתעוררים מההרדמה. בצע הזרקה זו של תערובת הקולגן ננו-חלקיקי כסף (20 μL) ארבע פעמים בתדירות של פעם בשבוע.הערה: העכברים שטופלו בתערובת הקולגן ננו-חלקיקי הכסף צריכים להישמר בכלובים נפרדים. קרבות עכברים עשויים להתרחש כאשר הם מתוחזקים יחד, וזה ישפיע על תוצאות הניסוי. במהלך ההזרקה תהיה תחושת מתח כאשר המחט מגיעה לחלל המפרק, ומתרחשת נפיחות במפרק הברך לאחר ההזרקה. השילוב של שתי שיטות אלה מאפשר לחוקר להבטיח כי התרופה הוזרק בהצלחה לתוך מפרק הברך. 4. איסוף מפרק הברך והרקמה הסינוביאלית להקריב את העכברים עם חנק פחמן דו חמצני או כל פרוטוקול אחר שאושר על ידי ועדת האתיקה הרלוונטית לבעלי חיים. לעקר ולנתח את העור ואת הרקמה התת עורית ברצף, ולחשוף באופן מלא את מפרק הברך. קצרו את מפרקי הברכיים, כולל עצם הירך והשוקה, והסירו את רקמות השרירים. יש לאסוף את רקמות מפרקי הברך, כולל עצם הירך, השוקה והרקמות הרכות שמסביב (רצועה וקפסולה), ב-10% פורמלין לשימור וקיבוע. 5. צביעת Hematoxylin-eosin לאחר קיבוע לילה, מטמיעים פרפין את המקטעים, ומשתמשים במיקרוטום כדי לחתוך את הרקמה המשובצת בפרפין לעובי 0.4 מיקרומטר. השתמש בחלקים המוכנים לצביעה נוספת (צביעת hematoxylin-eosin, Safranin O/Fast Green, וצביעה אימונוהיסטוכימית (IHC). מפרקים את החלקים פעמיים עם קסילן, משרים 100%, 95%, 80% ו-70% אתנול ברצף למשך 5 דקות כל אחד, ומחזירים נוזלים. צבעו את המקטעים עם המטוקסילין (0.1 גרם/100 מ”ל) למשך 5 דקות, ולאחר מכן הכניסו ישירות ל-1% HCl למשך 10 שניות ול-eosin (0.5 גרם/100 מ”ל) למשך דקה אחת. שימו לב לשינויים ההיסטופתולוגיים של הסינוביום תחת מיקרוסקופ. 6. ספרנין O/Fast Green הטמע את הרקמה בפרפין, והכן את החלקים ההיסטולוגיים כמתואר בשלב 5.1. יש לפרק את החלקים פעמיים עם קסילן, ולהלחין אותם מחדש עם סדרת אתנול (כגון 100%, 95%, 80% ו-70% אתנול במים מזוקקים, כל אחד למשך 5 דקות). מכתימים את החלקים המוכנים עם המטוקסילין, ושוטפים אותם עם PBS שלוש פעמים במשך 2 דקות כל אחד. להבדיל את החלקים עם אלכוהול חומצה הידרוכלורית, ולשטוף אותם עם PBS שלוש פעמים במשך 2 דקות כל אחד. יש לטבול את החלקים בתמיסת צביעה ירוקה מהירה 0.02% למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן צביעת 0.1% ספרנין O למשך 1-2 דקות. להבדיל את החלקים עם 1% חומצה אצטית, ואחריו שטיפת PBS. לזהות ולנתח היווצרות fibrocartilage בסעיפים. 7. צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) הטמיעו את הרקמה בפרפין, והכינו את החלקים ההיסטולוגיים כמתואר בשלב 5.1. יש לפרק את החלקים פעמיים עם קסילן, ולהלחין אותם מחדש עם סדרת אתנול (כגון 100%, 95%, 80% ו-70% אתנול במים מזוקקים, כל אחד למשך 5 דקות). יש לטבול את המקטעים במאגר Tris-EDTA (בסיס Tris של 10 mM, תמיסת EDTA של 1 mM; pH 9.0), ולחמם בתנור מיקרוגל בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות כדי לבצע אחזור אנטיגן. חשוף את החלקים לתמיסת מי חמצן 3% למשך 10 דקות כדי להסיר פרוקסידז אנדוגני. טפלו בחלקים עם סרום עיזים 5% כדי לחסום קשירה לא ספציפית. הוסף את הנוגדנים הראשוניים המדוללים (דילול 1:1,000) כנגד CD177, ודגור למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את החלקים עם PBS שלוש פעמים. השרו את המקטעים עם PBS, ודגרו על המקטעים עם הנוגדן המשני המתאים (HRP-conjugated polymer anti-rabbit system) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בצע הדמיה של צביעת IHC באמצעות 3,3′-diaminobenzidine (DAB) ככרומוגן. צפו בקטעים תחת מיקרוסקופ, ונתחו את התמונות שנרכשו.

Representative Results

מודל עכבר KOA הושרה באמצעות קולגנאז מסוג II. החל משבוע לאחר השראת הדגם, תערובת הקולגן המוכנה של ננו-חלקיקי כסף הוזרקה לחלל המפרק פעם בשבוע במשך 4 שבועות (איור 1). משקלי העכברים בכל קבוצה נצפו ותועדו מדי יום. התוצאות הראו כי משקל הגוף הממוצע של עכברי KOA היה נמוך משמעותית מזה של העכברים בקבוצת הביקורת הרגילה. אולם משקל הגוף הממוצע של עכברים בקבוצת collagenase + AgNPs מסוג II היה גבוה יותר בהשוואה לעכברי KOA, אף על פי שהבדל זה לא היה מובהק סטטיסטית (איור 2). לאחר 30 יום, הרקמות הסינוביאליות של מפרקי הברך נאספו מהעכברים ועברו בדיקה פתולוגית. ההיפרפלזיה, התפשטות כלי הדם, חדירה דלקתית של הסינוביום ונזק לסחוס נותחו 5,10,11. התוצאות הראו כי העובי הסינוביאלי של העכברים בקבוצת KOA היה גבוה משמעותית בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה. בקבוצה שטופלה בתערובת הקולגן של ננו-חלקיקי כסף, עובי הממברנה הסינוביאלית הופחת בהשוואה לקבוצת KOA (איור 3). הייתה היפרפלזיה וסקולרית בסינוביום של עכברי KOA בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה, וההיפרפלזיה של כלי הדם הופחתה באופן משמעותי בסינוביום של עכברים שטופלו בתערובת הקולגן של ננו-חלקיקי הכסף (איור 4). תוצאות צביעת ספרנין-O הראו שמטריצת הסחוס של עכברי KOA נהרסה, בעוד שהעכברים שטופלו בתערובת הקולגן של ננו-חלקיקי הכסף הראו מטריצת סחוס טובה יותר באופן משמעותי (איור 5). ציוני התכונות המורפולוגיות בכל קבוצה הוערכו כמתואר קודם22. התוצאות היו כדלקמן: 0 ± 0 עבור קבוצת המלוחים, 7 ± 0.63 עבור קבוצת הקולגן מסוג II, ו-4.2 ± 1.17 עבור קבוצת הקולגן מסוג II + AgNPs (איור 6). CD177 הוא סמן נויטרופילים עיקרי25. CD177 מתבטא ב-40%-60% מהנויטרופילים בתנאים רגילים. עם זאת, הביטוי של CD177 בנויטרופילים עולה באופן משמעותי במהלך דלקת חריפה. תוצאות צביעת IHC הראו כי הנויטרופילים שחדרו לאזור הסינוביאלי הופחתו באופן משמעותי בקבוצה שטופלה ב-AgNPs בהשוואה לקבוצת KOA (איור 7), מה שמרמז על כך שטיפול ב-AgNPs יכול לשפר את הסימפטומים של KOA. איור 1: מיקום ההזרקה. (A) תמונות מייצגות של הזרקת collagenase מסוג II. (B) תמונות מייצגות לאחר הזרקת collagenase מסוג II. (C) תמונות מייצגות של הזרקת תערובת קולגן ננו-חלקיקי כסף במודל עכבר KOA. (D) תמונות מייצגות לאחר הזרקת תערובת קולגן ננו-חלקיקי כסף בעכברי מודל KOA. הקו המקווקו האדום מייצג את הקו המקביל לרצועות ברכי העכבר. החץ השחור מייצג את הזווית בין מחט מזרק האינסולין לבין העור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: שינויים במשקל הגוף של עכברים בכל קבוצה. לוח זה מציג את המשקל הממוצע של העכברים בכל קבוצה בנקודות זמן שונות; ציר ה-X מציין את מספר הימים לאחר הזרקת קולגן מסוג II, וציר ה-Y מציין את השינוי במשקל הגוף. קבוצת מלח (n = 7), קבוצת collagenase מסוג II (n = 5), קבוצת collagenase מסוג II + קבוצת AgNPs (n = 5). *P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: צביעת Hematoxylin-eosin (H&E) המייצגת היפרפלזיה סינוביאלית. הרקמות הסינוביאליות בכל קבוצת עכברים נאספו, תוקנו, נחתכו ונצבעו ב-H&E 30 יום לאחר הניתוח. החצים הכפולים מייצגים את העובי הסינוביאלי שזוהה. סרגל קנה מידה = 0.1 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: תמונה מייצגת של היפרפלזיה וסקולרית פריסינוביאלית. החיצים מציינים את הכלים. סרגל קנה מידה = 0.05 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: צביעת ספרנין-O של מפרק הברך בכל קבוצת עכברים. סרגל קנה מידה = 0.2 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: ציוני תכונות מורפולוגיות בכל קבוצה. הרקמה הסינוביאלית שימשה למדידת ציון התכונות המורפולוגיות של העכברים בכל קבוצה. חמישה קטעי רקמה בכל קבוצה נבחרו כדי לנתח את מידת ההיפרפלזיה/הגדלה של שכבת התא הסינוביאלית, את מידת חדירת הנויטרופילים ברקמה הסינוביאלית, ואת מידת ההפעלה של הסטרומה הסינוביאלית (טבלה 1). הערך הממוצע שימש כציון הסופי. **p < 0.01 ו- ***p < 0.001 עם מבחן t של סטודנט עבור כל קבוצה בהשוואה לקבוצת KOA שלא טופלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: צביעה אימונוהיסטוכימית של סמן נויטרופיל ברקמה הסינוביאלית בכל קבוצת עכברים. צביעה אימונוהיסטוכימית שימשה לזיהוי ביטוי סמן הנויטרופילים CD177 ברקמה הסינוביאלית של העכברים בכל קבוצה. החיצים מצביעים על נויטרופילים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. טבלה 1: ניקוד תכונות מורפולוגיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

לננו-חלקיקי כסף יש השפעות אנטי-דלקתיות, אנטי-בקטריאליות, נוגדות חמצון ואימונומודולטוריות, כלומר הם יכולים להגן על תאים ורקמות מפני נזק על ידי הפחתת הייצור של מיני חמצן תגובתי26. כמה חוקרים מודאגים לגבי הרעילות של חלקיקי כסף27. הרעילות של חלקיקי כסף קשורה ישירות לנוכחותם של יוני כסף חופשיים. בשל גודלם הננומטרי של חלקיקי כסף, הם יכולים בקלות להפריע לביומולקולות, תאים ואיברים אנושיים 15,28,29. מספר מחקרים דיווחו כי ננו-חלקיקי כסף עלולים לגרום לעקה חמצונית ולפגוע בתפקוד המיטוכונדריה בתאים אנושיים30. בנוסף, Ag יכול להיות מזוהה באיברים אנושיים, במיוחד בכבד ובטחול, לאחר השימוש בכמויות גדולות של חלקיקי כסף. חוקרים דיווחו גם כי לננו-חלקיקי כסף יש את היכולת לחצות את מחסום הדם-מוח באמצעות תחבורה טרנס-סינפטית ולהצטבר במוח31. דו”ח שיטתי של הרעילות הביולוגית של חלקיקי כסף לא נערך, אם כי כמה חוקרים מכירים בבטיחות של חלקיקי כסף32.

במחקר זה הכנו תערובת קולגן ננו-חלקיקי כסף. אכן, משך הזמן של ננו-חלקיקי כסף ברקמות אנושיות הוא קצר, אך ניתן להאריך את משך הזמן של ננו-חלקיקי כסף כאשר מיישמים אותם עם תערובת קולגן; זה לא רק מפחית את הטראומה אלא גם את מינון התרופות. בהתחשב ברעילות של חלקיקי כסף, המינון של חלקיקי כסף שיושם במחקר זה היה 30 מ”ג / ק”ג, בקנה אחד עם מחקר קודם33.

להלן מספר שיקולים חיוניים של פעולת הניסוי. יש לאחסן collagenase מסוג II בטמפרטורה של -20°C לאחר ההכנה כדי למנוע התפרקות עקב מחשוף אנזימטי. הכנת תערובת הקולגן של ננו-חלקיקי הכסף חייבת להתבצע על הקרח ברציפות בטמפרטורת החדר מכיוון שתערובת הקולגן של ננו-חלקיקי הכסף הופכת לג’ל מוצק למחצה במהירות ואז לא ניתן להשתמש בה להזרקה. הפתרון צריך להיות מאוחסן ב 4 °C לאחר ההכנה. מזרק אינסולין 1 מ”ל עם מחט קטנה יותר צריך להיות נבחר לניהול תוך מפרקי, וזה יכול למנוע ביעילות את דליפת התרופות המוזרקות. יש להחדיר את המחט בזווית של 15° כדי להזריק את תערובת הקולגן ננו-חלקיקי כסף. כאשר המחט אינה עמידה, הדבר מצביע על כך שהמחט הגיעה לחלל מפרק הברך. לאחר ההזרקה, יש לשנות את זווית ההזרקה, ויש למשוך את המחט לאט כדי למנוע דליפה של התרופה המוזרקת.

במחקר זה, ננו-חלקיקי כסף שיפרו ביעילות את הסימפטומים של KOA המושרה על ידי קולגנאז מסוג II בעכברים, והדגימו את ההשפעה האנטי דלקתית של ננו-חלקיקי כסף. מספר מחקרים דיווחו על נוכחות אפופטוזיס בתאים מודגרים במבחנה עם חלקיקי כסף 34,35,36. הירידה בהיפרפלזיה סינוביאלית יכולה הייתה להיגרם על ידי חלקיקי הכסף בשל מעורבותם בפגיעה בתפקוד המיטוכונדריה, או שתוצאות אלה היו מתווכות על ידי מיני חמצן תגובתי. היפרפלזיה וסקולרית נצפתה בסינוביום של עכברים בקבוצת מודל KOA. ייתכן שכימוקינים העבירו נויטרופילים מכלי הדם לרקמה הסינוביאלית בתהליך זה וכי פרץ הדלקת גרם לתאים לצרוך יותר חמצן, ובכך הוביל להיפרפלזיה וסקולרית. לפיכך, נדרשים ניסויים נוספים כדי להוכיח את אמינותה של השערה זו. מחקר זה מספק יתרונות תיאורטיים למחקר בטיפול ב- KOA קליני. במחקרים עתידיים, אנו שואפים לשלב את שיטת הרצועה הצולבת הקדמית (ACL) יחד עם שיטת מודל KOA המושרה כימית כדי לבחון את ההשפעה של ננו-חלקיקי כסף. תוצאות הניסוי מראות כי ננו-חלקיקי כסף יכולים להפחית באופן משמעותי את חדירת תאי הדלקת בסינוביום בעכברי KOA, אך המנגנונים של השפעה זו עדיין זקוקים למחקר נוסף, שעשוי לפענח את הפתוגנזה של KOA.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מספר: 2019A1515010209) ופרויקט המדע והטכנולוגיה של העיר גואנגג’ואו, סין (מספר: 202102010164).

Materials

1 mL insulin syringe BD 305932 None
CD177 Polyclonal Antibody ThermoFisher Scientific PA5-98759 None
Chloral hydrate Sigma-Aldrich 302-17-0 None
DAB MCE HY-15912 None
Eosin Beyotime Biotechnology C0109 None
Formalin Sigma-Aldrich HT501128 None
Hematoxylin Beyotime Biotechnology C0107 None
Light Microscopy Leica DM500 None
Silver nanoparticle Wolcacvi  S-10-20 Store product in the dark at 4°C
Safranine O-Fast Green FCF Cartilage Stain Kit Solarbio 90-15-3 None
Type II collagen Sigma-Aldrich C6885-500mg None
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, 19 (2016).
  2. Kraus, V. B., Blanco, F. J., Englund, M., Karsdal, M. A., Lohmander, L. S. Call for standardized definitions of osteoarthritis and risk stratification for clinical trials and clinical use. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (8), 1233-1241 (2015).
  3. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  4. de Sousa, E. B., Casado, P. L., Moura, N. V., Duarte, M. E., Aguiar, D. P. Synovial fluid and synovial membrane mesenchymal stem cells: Latest discoveries and therapeutic perspectives. Stem Cell Research and Therapy. 5 (5), 112 (2014).
  5. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  6. Glyn-Jones, S., et al. Osteoarthritis. Lancet. 386 (9991), 376-387 (2015).
  7. Roemer, F. W., et al. Presence of MRI-detected joint effusion and synovitis increases the risk of cartilage loss in knees without osteoarthritis at 30-month follow-up: The MOST study. Annals of Rheumatic Diseases. 70 (10), 1804-1809 (2011).
  8. Furman, B. D., et al. Articular ankle fracture results in increased synovitis, synovial macrophage infiltration, and synovial fluid concentrations of inflammatory cytokines and chemokines. Arthritis and Rheumatology. 67 (5), 1234-1239 (2015).
  9. Ayral, X., Pickering, E. H., Woodworth, T. G., Mackillop, N., Dougados, M. Synovitis: A potential predictive factor of structural progression of medial tibiofemoral knee osteoarthritis — Results of a 1 year longitudinal arthroscopic study in 422 patients. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (5), 361-367 (2005).
  10. Henrotin, Y., Lambert, C., Richette, P. Importance of synovitis in osteoarthritis: Evidence for the use of glycosaminoglycans against synovial inflammation. Seminars in Arthritis and Rheumatism. 43 (5), 579-587 (2014).
  11. Liu-Bryan, R. Synovium and the innate inflammatory network in osteoarthritis progression. Current Rheumatology Reports. 15 (5), 323 (2013).
  12. Towheed, T., Shea, B., Wells, G., Hochberg, M. Analgesia and non-aspirin, non-steroidal anti-inflammatory drugs for osteoarthritis of the hip. Cochrane Database of Systematic Reviews. (2), (2000).
  13. Co, C. M., et al. Click chemistry-based pre-targeting cell delivery for cartilage regeneration. Regenerative Biomaterials. 8 (3), (2021).
  14. Oo, W. M., Liu, X., Hunter, D. J. Pharmacodynamics, efficacy, safety and administration of intra-articular therapies for knee osteoarthritis. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 15 (12), 1021-1032 (2019).
  15. Morozova, O. V. Silver nanostructures: Limited sensitivity of detection, toxicity and anti-inflammation effects. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 9928 (2021).
  16. He, M., et al. A pH-responsive mesoporous silica nanoparticles-based drug delivery system with controlled release of andrographolide for OA treatment. Regenerative Biomaterials. 8 (4), (2021).
  17. Samuel, M. S., Jose, S., Selvarajan, E., Mathimani, T., Pugazhendhi, A. Biosynthesized silver nanoparticles using Bacillus amyloliquefaciens; Application for cytotoxicity effect on A549 cell line and photocatalytic degradation of p-nitrophenol. Journal of Photochemistry and Photobiology B. 202, 111642 (2020).
  18. Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
  19. Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2007).
  20. Vendidandala, N. R., et al. Gallocatechin-silver nanoparticle impregnated cotton gauze patches enhance wound healing in diabetic rats by suppressing oxidative stress and inflammation via modulating the Nrf2/HO-1 and TLR4/NF-kappaB pathways. Life Sciences. 286, 120019 (2021).
  21. Kikuchi, T., Sakuta, T., Yamaguchi, T. Intra-articular injection of collagenase induces experimental osteoarthritis in mature rabbits. Osteoarthritis and Cartilage. 6 (3), 177-186 (1998).
  22. Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  23. Zhao, Z., et al. Design and synthesis of Ag NPs/chitosan-starch nano-biocomposite as a modern anti-human malignant melanoma drug. International Journal of Biological Macromolecules. 236, 123823 (2023).
  24. Ahmed, E., et al. Decellularized extracellular matrix-rich hydrogel-silver nanoparticle mixture as a potential treatment for acute liver failure model. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 108 (12), 2351-2367 (2020).
  25. Bai, M., et al. CD177 modulates human neutrophil migration through activation-mediated integrin and chemoreceptor regulation. Blood. 130 (19), 2092-2100 (2017).
  26. Singh, D., Chaudhary, D., Kumar, V., Verma, A. Amelioration of diethylnitrosamine (DEN) induced renal oxidative stress and inflammation by Carissa carandas embedded silver nanoparticles in rodents. Toxicology Reports. 8, 636-645 (2021).
  27. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: The DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30 (23-24), 3891-3914 (2009).
  28. Noronha, V. T., et al. Silver nanoparticles in dentistry. Dental Materials. 33 (10), 1110-1126 (2017).
  29. Ahamed, M., Alsalhi, M. S., Siddiqui, M. K. Silver nanoparticle applications and human health. Clinica Chimica Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  30. Palacios-Hernandez, T., et al. cellular uptake and apoptotic responses in human coronary artery endothelial cells exposed to ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Applied Toxicology. 40 (7), 918-930 (2020).
  31. Lebda, M. A., et al. Potential role of alpha-lipoic acid and Ginkgo biloba against silver nanoparticles-induced neuronal apoptosis and blood-brain barrier impairments in rats. Life Sciences. 212, 251-260 (2018).
  32. Yin, I. X., et al. The antibacterial mechanism of silver nanoparticles and its application in dentistry. International Journal of Nanomedicine. 15, 2555-2562 (2020).
  33. Kim, Y. S., et al. Subchronic oral toxicity of silver nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 7, 20 (2010).
  34. Pascarelli, N. A., et al. Effects of gold and silver nanoparticles in cultured human osteoarthritic chondrocytes. Journal of Applied Toxicology. 33 (12), 1506-1513 (2013).
  35. Braydich-Stolle, L. K., et al. Silver nanoparticles disrupt GDNF/Fyn kinase signaling in spermatogonial stem cells. Toxicological Sciences. 116 (2), 577-589 (2010).
  36. Eom, H. J., Choi, J. p38 MAPK activation, DNA damage, cell cycle arrest and apoptosis as mechanisms of toxicity of silver nanoparticles in Jurkat T cells. Environmental Science and Technology. 44 (21), 8337-8342 (2010).

Tags

Silver NanoparticlesOsteoarthritisKnee JointCollagenaseType 1 CollagenSurgical ProcedureAnimal ExperimentationJoint InjectionInflammation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sang, Y., Zhang, J., Liu, C., Liu, K., Yao, H., Zhao, H., Xu, W., Xu, Y., Hou, G. Ameliorating Osteoarthritis in Mice Using Silver Nanoparticles. J. Vis. Exp. (196), e65111, doi:10.3791/65111 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image