銀ナノ粒子を用いたマウスの変形性関節症の改善

すべての動物実験は、広州フォーエバーゲン医療実験動物センターの動物倫理福祉委員会(AEWC)によって承認されました(2018-0186)。 1. KOAマウスモデルの構築 BALB/cマウス(18-24g;12-14週齢)を湿度70%、26°C、明暗サイクル12時間で維持する。この実験では、動物は広州フォーエバーゲン医学実験動物センターで飼育されました。 II型コラーゲンを使用して、前述のようにKOAマウスモデルを確立します21。以下に説明するように関節内注射を行います。.麻酔には2%ペントバルビタールナトリウム(40 mg / kg)、鎮痛にはブプレノルフィン(0.05 mg / kg、皮下注射)を適用します。.次に、マウスの手足をテープで固定し、カミソリで毛を取り除き、0.1%ヨードフォアとアルコールを交互に3回こすり洗いして消毒します。 滅菌手袋を着用し、滅菌ハサミを使用して、皮膚、皮下組織、膝蓋骨下靭帯を順番に露出させます。切開面積は0.5cm未満に保ちます。注:手術中にマウスの体温を維持するために、加熱ブランケットを使用しました。 1 mLのインスリン注射器を使用して、10 Uの30 mg / kg(0.4 mg / mL)II型コラゲナーゼを関節腔(膝蓋骨下靭帯の下)に注入します22。注意: 針と皮膚の間の角度は約15°である必要があります。次に、針の方向を変え、針を完全に引き抜く必要があります。 注射後、最初に皮下組織を縫合し、次に皮膚を縫合します。縫合部を0.1%ヨードフォアで滅菌します。マウスが麻酔から目覚めた後、個別に換気ケージ(IVC)に入れます。 2. 銀ナノ粒子の合成 注:銀ナノ粒子の調製は、以前に詳細に説明した19。調合プロセス全体は氷上で行われます。調製後、混合物を4°Cで保存する。そうでなければ、混合物は室温で容易に固化する。 合計400μLのI型コラーゲン(4mg/mL)を1.5mLの微量遠心チューブに加え、氷上に置いた。 上記のコラーゲンに合計200μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、溶液をよく混ぜて氷上に置く。 最後に、上記の溶液に400μLの銀ナノ粒子を加え、十分に混合します。ナノ粒子溶液の最終濃度は1mMです。注:銀ナノ粒子の平均直径は、5nm〜15nmの範囲である23。これは電子顕微鏡によって確認されました。 3. II型コラゲナーゼ誘導KOAマウスの銀ナノ粒子処理 1週間後にII型コラゲナーゼ誘導KOAマウスをケージから取り出し、銀ナノ粒子を注入します。銀ナノ粒子を週に1回注入し、30日後に検体を採取します。 麻酔用に合計2%ペントバルビタールナトリウム(用量:2 mL / kg)を腹腔内注射 で 注射し、手順1.2の説明に従って皮膚を固定、準備、および滅菌します。. 滅菌手袋を着用し、滅菌ハサミを使用して、皮膚、皮下組織、膝靭帯を順番に露出させます。 1 mLのインスリン注射器を使用し、針で15°の角度で関節腔に入ります。約20μLの銀ナノ粒子コラーゲン混合物をゆっくりと注入し、針24をゆっくりと引き抜く。 皮下組織と皮膚を順番に縫合し、滅菌します。マウスが麻酔から目覚めた後、個別に換気ケージ(IVC)に入れます。 この銀ナノ粒子コラーゲン混合物(20μL)の注入を週に1回の頻度で4回行います。注:銀ナノ粒子コラーゲン混合物で処理したマウスは、個別のケージで保管する必要があります。マウス同士が一緒に飼育されていると、ネズミの喧嘩が起こり、実験結果に影響が出るかもしれません。注射中、針が関節腔に達すると緊張感があり、注射後に膝関節に腫れが生じます。これら2つの方法を組み合わせることで、研究者は薬物が膝関節に正常に注入されたことを確認できます。 4.膝関節と滑膜組織の収集 マウスを二酸化炭素窒息または関連する動物倫理委員会によって承認されたその他のプロトコルで犠牲にします。 皮膚と皮下組織を順次滅菌および解剖し、膝関節を完全に露出させます。 大腿骨と脛骨を含む膝関節を採取し、筋肉組織を取り除きます。 大腿骨、脛骨、および周囲の軟部組織(靭帯と被膜)を含む膝関節組織を10%ホルマリンで収集し、保存と固定を行います。 5. ヘマトキシリン-エオシン染色 一晩固定した後、切片をパラフィン包埋し、ミクロトームを使用してパラフィン包埋組織を0.4μmの厚さに切断します。調製した切片をさらなる染色(ヘマトキシリン-エオシン染色、サフラニンO/ファストグリーン染色、免疫組織化学(IHC)染色)に使用します。 切片をキシレンで2回脱パラフィンし、100%、95%、80%、70%のエタノールを順番に5分間ずつ浸し、再水和します。 切片をヘマトキシリン(0.1 g/100 mL)で5分間染色した後、1%塩酸で10秒間、エオシン(0.5 g/100 mL)で1分間直接入れます。 滑膜の組織病理学的変化を顕微鏡で観察します。 6.サフラニンO /ファストグリーン 組織をパラフィンに包埋し、ステップ5.1の説明に従って組織切片を調製します。 切片をキシレンで2回脱パラフィンし、エタノールシリーズ(蒸留水に100%、95%、80%、70%エタノールをそれぞれ5分間)で再水和します。 調製した切片をヘマトキシリンで染色し、PBSで3回、それぞれ2分間洗浄します。 塩酸アルコールで切片を分別し、PBSで2分間ずつ3回洗浄します。 切片を0.02%ファストグリーン染色溶液に5〜10分間浸し、続いて0.1%サフラニンO染色を1〜2分間浸します。 切片を1%酢酸で区別し、続いてPBS洗浄します。 切片の線維軟骨形成を検出して分析します。 7. 免疫組織化化学(IHC)染色 組織をパラフィンに包埋し、ステップ5.1で説明したように組織切片を調製する。 切片をキシレンで2回脱パラフィンし、エタノールシリーズ(蒸留水に100%、95%、80%、70%エタノールをそれぞれ5分間)で再水和します。切片をTris-EDTAバッファー(10 mM Tris 塩基、1 mM EDTA溶液、pH 9.0)に浸漬し、95°Cの電子レンジで10分間加熱して抗原賦活化を行います。 切片を3%過酸化水素溶液に10分間曝露し、内因性ペルオキシダーゼを除去します。 切片を5%ヤギ血清で処理して、非特異的結合をブロックします。 希釈したCD177に対する一次抗体(1:1,000希釈)を添加し、4°Cで一晩インキュベートします。 次に、切片をPBSで3回洗浄します。 切片をPBSに浸し、適切な二次抗体(HRP標識ポリマー抗ウサギ系)と室温で30分間インキュベートします。 3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)を発色剤として使用してIHC染色の可視化を行います。 切片を顕微鏡で観察し、取得した画像を解析します。