Hücre Kültürü için Fetal Fare İskelet Kasından 3D Desellülarize Matrislerin Hazırlanması
Summary
Bu çalışmada, fetal fare iskelet kasının desellülarize matrislerini elde etmek için bir desellülarizasyon protokolü optimize edilmiştir. C2C12 miyoblastlar bu matrisleri kolonize edebilir, çoğalabilir ve farklılaşabilir. Bu in vitro model, kas distrofileri gibi iskelet kası hastalıkları bağlamında hücre davranışını incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Hücre dışı matris (ECM), hücreler için yapısal destek sağlamada ve çeşitli hücresel süreçler için önemli olan sinyalleri iletmede çok önemli bir rol oynar. İki boyutlu (2B) hücre kültürü modelleri, hücreler ve ECM arasındaki karmaşık etkileşimleri aşırı basitleştirir, çünkü tam bir üç boyutlu (3B) desteğin olmaması hücre davranışını değiştirebilir ve in vivo süreçleri anlamak için onları yetersiz hale getirebilir. ECM kompozisyonundaki eksiklikler ve hücre-ECM etkileşimleri, çeşitli farklı hastalıklara önemli katkıda bulunur.
Bir örnek, fonksiyonel laminin 211 ve 221’in yokluğunun veya azalmasının, doğumda veya hemen sonrasında tespit edilebilen ciddi hipotoniye yol açabileceği LAMA2-konjenital kas distrofisidir (LAMA2-CMD). Hastalığın bir fare modelini kullanan önceki çalışmalar, başlangıcının fetal miyogenez sırasında meydana geldiğini göstermektedir. Bu çalışma, doğal mikro çevreyi taklit ederek, kas hücreleri ve fetal kas ECM arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin veren bir 3D in vitro model geliştirmeyi amaçlamıştır. Bu protokol, E18.5 fare fetüslerinden diseke edilen, hipotonik tampon, anyonik deterjan ve DNaz ile muamele edilen derin sırt kaslarını kullanır. Elde edilen desellülarize matrisler (dECM’ler), doğal dokuya kıyasla test edilen tüm ECM proteinlerini (laminin α2, toplam lamininler, fibronektin, kollajen I ve kollajen IV) korudu.
C2C12 miyoblastları bu dECM’lerin üzerine tohumlandığında, çoğalmalarını ve farklılaşmalarını destekleyen dECM’lere nüfuz ettiler ve kolonize oldular. Ayrıca, C2C12 hücreleri ECM proteinleri üretti ve dECM’ler içindeki nişlerinin yeniden şekillenmesine katkıda bulundu. Bu in vitro platformun kurulması, LAMA2-CMD’nin başlangıcında yer alan süreçleri çözmek için umut verici yeni bir yaklaşım sağlar ve ECM ile iskelet kası hücreleri arasındaki iletişimdeki eksikliklerin hastalığın ilerlemesine katkıda bulunduğu diğer iskelet kası hastalıklarına uyarlanma potansiyeline sahiptir.
Introduction
Hücre dışı matriks (ECM), hücresel olmayan bileşenlerini temsil eden dokuların önemli bir bileşenidir. Bu üç boyutlu (3B) yapı sadece hücreler için fiziksel destek sağlamakla kalmaz, aynı zamanda organizmaların gelişiminde yer alan biyokimyasal süreçlerde de çok önemli bir rol oynar1. Dokuya özgü bir ECM’nin oluşumu, çeşitli hücre içi ve hücre dışı uyaranlardan etkilenen hücreler ve nişleri arasındaki karmaşık etkileşimlerin bir sonucu olarak, gelişim sırasında ortaya çıkar. ECM, zamansal-mekansal bir şekilde kimyasal ve mekanik yeniden düzenlemelere tabi tutulan ve hücre kaderini doğrudan etkileyen oldukça dinamik bir yapıdır2. ECM’nin en dikkat çekici özelliklerinden biri, fonksiyonel çeşitliliğidir, çünkü her doku ECM, içerdiği hücrelere uyarlanmış farklı topolojiler ve özellikler sağlayan benzersiz bir molekül kombinasyonu gösterir1.
ECM sinyalizasyonu ve desteği, gelişim ve homeostaz için çok önemlidir ve bozulduğunda çoklu patolojik durumlara yol açabilir 3,4. Bir örnek, konjenital müsküler distrofinin en yaygın şekli olan LAMA2 eksikliği konjenital distrofidir (LAMA2-CMD). LAMA2 geni, laminin 211 ve laminin 221’de bulunan laminin α2 zincirini kodlar ve mutasyona uğradığında LAMA2-CMD 5’e yol açabilir. Laminin 211, iskelet kası liflerini çevreleyen bazal membranda bulunan ana izoformdur. Laminin 211 anormal veya eksik olduğunda, bazal membran ve kas hücreleri arasındaki bağlantı bozulur ve hastalığın başlangıcına yol açar6. LAMA2-CMD’li hastalar, LAMA2 genindeki mutasyon tipine bağlı olarak hafif ila şiddetli bir fenotip gösterir.
Laminin α2 proteininin işlevi etkilendiğinde, hastalar doğumda ciddi kas hipotonisi yaşayabilir ve kronik inflamasyon, fibroz ve kas atrofisi geliştirerek yaşam beklentisinin azalmasına neden olabilir. Bugüne kadar hedefe yönelik herhangi bir tedavi geliştirilmemiştir ve tedavi yaklaşımları hastalığın semptomlarını hafifletmekle sınırlıdır7. Bu nedenle, bu hastalığın başlangıcında rol oynayan altta yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, uygun terapötik stratejilerin geliştirilmesi için çok önemlidir 6,8. LAMA2-CMD için bir model olan dyW fare9’u kullanan önceki çalışmalar, hastalığın başlangıcının utero’da, özellikle fetal miyogenez10 sırasında başladığını göstermektedir. Fetal miyogenez defektinin nasıl ortaya çıktığının daha iyi anlaşılması, LAMA2-CMD için yeni terapötik yaklaşımlar üretmede bir oyun değiştirici olacaktır.
İn vitro sistemler, hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimlerini incelemek için kontrollü bir ortam sağlar, ancak 2D kültür modelleri doğal dokuların karmaşıklığından yoksundur. Dokuların desellülarizasyonu, 2D modellere ve mühendislik / sentetik iskelelere kıyasla doğal hücre mikro ortamını daha doğru bir şekilde taklit eden doku ve gelişim aşamasına özgü asellüler ECM iskeleleri üretir. Desellülarize matrisler (dECM’ler), konakçı dokunun moleküler ve mekanik ipuçlarını koruma potansiyeline sahiptir ve bu da onları in vivo süreçleri anlamak için daha iyi alternatif modeller haline getirir11.
Hücresizleştirme için kullanılabilecek çeşitli teknikler, reaktifler ve koşullar vardır12,13. Bu çalışmada, Silva ve ark.14,15 tarafından tanımlanan fetal fare kalbi için bir desellülarizasyon protokolü, fetal fare iskelet kasına uyarlanmış ve test edilen tüm ECM bileşenlerini (laminin α2, toplam lamininler, fibronektin, kollajen I ve kollajen IV) koruduğu bulunmuştur. Protokol üç adımdan oluşur: ozmotik şok (hipotonik tampon) ile hücre lizisi, plazma membranı çözünmesi ve protein ayrışması (% 0.05 sodyum dodesil sülfat [SDS]) ve DNA’nın enzimatik yıkımı (DNaz tedavisi). Bildiğimiz kadarıyla bu, fare fetal iskelet kasının hücre deselülizasyonu için kurulan ilk protokoldür.
Bu 3D in vitro sistemi LAMA2-CMD’yi incelemek için kullanmak için, hücresizleştirmeden sonra laminin α2 zincirini korumak çok önemlidir. Bu nedenle, farklı deterjanların (SDS ve Triton X-100) ve konsantrasyonların (% 0.02,% 0.05,% 0.1,% 0.2 ve% 0.5) test edildiği bir optimizasyon protokolü uygulanmıştır (veriler gösterilmemiştir). Laminin α2 proteininin hücre çıkarılması ve korunması için en uygun seçenek %0.05 SDS olarak bulunmuştur. İyi kurulmuş bir miyoblast hücre hattı olan C2C12 hücreleri16,17, dECM’leri tohumlamak için kullanıldı. Bu hücreler dECM’yi istila eder, çoğalır ve bu iskelelerin içinde farklılaşarak yeni ECM proteinlerini sentezler. Bu 3D in vitro modelin başarılı üretimi, fetal miyogenezde, LAMA2-CMD’nin başlangıcında yer alan moleküler ve hücresel süreçleri anlamak için yeni bir yaklaşım sunar ve ECM ile iskelet kası hücreleri arasındaki iletişimin bozulduğu diğer kas hastalıklarına genişletilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM, tüm dokularda bulunan ve hücre davranışını ve fonksiyonunu düzenlemede çok önemli bir rol oynayan karmaşık bir makromolekül ağıdır2. ECM, hücrelerin bağlanması için fiziksel bir iskele görevi görür ve proliferasyon, motilite, farklılaşma ve apoptoz gibi hücresel süreçleri aktif olarak modüle eden ipuçları sağlar. Bu nedenle, ECM’nin uygun şekilde oluşturulması ve sürdürülmesi hem gelişim hem de homeostaz1 için gereklidir.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; sözleşme no. 23049), MATRIHEALTH projesi ve UIDB/00329/2020 tarafından finanse edilen cE3c birimi tarafından finanse edilmiştir. MATRIHEALTH Projesi’ni desteklemeyi seçen bağışçımız Henrique Meirelles’e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Portekiz BioImaging Platformunun bir düğümü olan Fen Fakültesi Mikroskopi Tesisi’nin altyapılarından yararlanmıştır (referans PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) ve Luís Marques’e görüntü edinme ve işleme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Son olarak, teknik destek için Marta Palma’ya ve cömert katkıları için araştırma ekibimize teşekkür ederiz.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
