Voorbereiding van 3D gedecellulariseerde matrices van foetale muis skeletspieren voor celkweek

De extracellulaire matrix (ECM) is een belangrijk bestanddeel van weefsels, die hun niet-cellulaire component vertegenwoordigen. Deze driedimensionale (3D) structuur biedt niet alleen fysieke ondersteuning voor cellen, maar speelt ook een cruciale rol in de biochemische processen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van organismen¹. De vorming van een weefselspecifieke ECM vindt plaats tijdens de ontwikkeling, als gevolg van de complexe interacties tussen cellen en hun niches, beïnvloed door verschillende intra- en extracellulaire stimuli. De ECM is een zeer dynamische structuur die chemische en mechanische herschikkingen ondergaat op een temporeel-ruimtelijke manier en direct van invloed is op het lot van de cel². Een van de meest opvallende kenmerken van de ECM is de functionele diversiteit, omdat elke weefsel-ECM een unieke combinatie van moleculen vertoont die verschillende topologieën en eigenschappen bieden die zijn afgestemd op de cellen die het bevat¹.

ECM-signalering en -ondersteuning zijn cruciaal voor ontwikkeling en homeostase en kunnen bij verstoring leiden tot meerdere pathologische aandoeningen ^3,4. Een voorbeeld is LAMA2-deficiënte congenitale dystrofie (LAMA2-CMD), de meest voorkomende vorm van congenitale spierdystrofie. Het LAMA2-gen codeert voor de laminine α2-keten, die aanwezig is in laminine 211 en laminine 221, en wanneer gemuteerd kan leiden tot LAMA2-CMD ⁵. Laminine 211 is de belangrijkste isovorm die wordt aangetroffen in het keldermembraan rond skeletspiervezels. Wanneer laminine 211 abnormaal of afwezig is, wordt de verbinding tussen het keldermembraan en spiercellen verstoord, wat leidt tot het begin van de ziekte⁶. Patiënten met LAMA2-CMD vertonen een mild tot ernstig fenotype, afhankelijk van het type mutatie in het LAMA2-gen.

Wanneer de functie van het laminine α2-eiwit wordt beïnvloed, kunnen patiënten bij de geboorte ernstige spierhypotonie ervaren en chronische ontsteking, fibrose en spieratrofie ontwikkelen, wat leidt tot een verminderde levensverwachting. Tot op heden zijn er geen gerichte behandelingen ontwikkeld en zijn therapeutische benaderingen beperkt tot het verlichten van de symptomen van de ziekte⁷. Daarom is het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij het ontstaan van deze ziekte cruciaal voor het ontwikkelen van geschikte therapeutische strategieën ^6,8. Eerder werk met behulp van de dy^{W-muis 9}, een model voor LAMA2-CMD, suggereert dat het begin van de ziekte begint in utero, met name tijdens foetale myogenese¹⁰. Een beter begrip van hoe het foetale myogenesedefect ontstaat, zou een game changer zijn bij het genereren van nieuwe therapeutische benaderingen voor LAMA2-CMD.

In vitro systemen bieden een gecontroleerde omgeving voor het bestuderen van cel-cel en cel-ECM interacties, maar 2D-cultuurmodellen missen de complexiteit van inheemse weefsels. Decellularisatie van weefsels produceert weefsel- en ontwikkelingsstadiumspecifieke acellulaire ECM-scaffolds die de natuurlijke celmicro-omgeving nauwkeuriger nabootsen in vergelijking met 2D-modellen en gemanipuleerde / synthetische steigers. Gedecellulariseerde matrices (dECM’s) hebben het potentieel om de moleculaire en mechanische signalen van het gastheerweefsel te behouden, waardoor ze betere alternatieve modellen zijn voor het begrijpen van in vivo processen¹¹.

Er zijn verschillende technieken, reagentia en aandoeningen die kunnen worden gebruikt voor decellularisatie^12,13. In deze studie wordt een decellularisatieprotocol voor het foetale muizenhart, beschreven door Silva et al.14,15, aangepast aan de skeletspieren van de foetale muis en blijkt het alle geteste ECM-componenten (laminine α2, totale laminines, fibronectine^, collageen I en collageen IV) te behouden. Het protocol omvat drie stappen: cellyse door osmotische shock (hypotone buffer), plasmamembraanoplossing en eiwitdissociatie (0,05% natriumdodecylsulfaat [SDS]) en enzymatische vernietiging van DNA (DNase-behandeling). Voor zover wij weten, is dit het eerste vastgestelde protocol voor het decellulariseren van foetale skeletspieren van muizen.

Om dit 3D in vitro systeem te gebruiken voor het bestuderen van LAMA2-CMD, is het cruciaal om de laminine α2 keten te behouden na decellularisatie. Daarom werd een optimalisatieprotocol geïmplementeerd waarbij verschillende detergentia (SDS en Triton X-100) en concentraties (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% en 0,5%) werden getest (gegevens niet getoond). De optimale keuze voor celverwijdering en conservering van het laminine α2-eiwit bleek 0,05% SDS te zijn. C2C12-cellen, een gevestigde myoblastcellijn^16,17, werden gebruikt om de dECM’s te zaaien. Deze cellen dringen de dECM binnen, prolifereren en differentiëren in deze steigers, waardoor nieuwe ECM-eiwitten worden gesynthetiseerd. De succesvolle productie van dit 3D in vitro model biedt een nieuwe benadering voor het begrijpen van de moleculaire en cellulaire processen die betrokken zijn bij foetale myogenese, het begin van LAMA2-CMD, en kan worden uitgebreid naar andere spierziekten waar de communicatie tussen de ECM en skeletspiercellen wordt verstoord.