Préparation de matrices décellularisées 3D à partir de muscle squelettique de souris fœtale pour culture cellulaire

La matrice extracellulaire (MEC) est un constituant majeur des tissus, représentant leur composante non cellulaire. Cette structure tridimensionnelle (3D) fournit non seulement un soutien physique aux cellules, mais joue également un rôle crucial dans les processus biochimiques impliqués dans le développement des organismes¹. La formation d’une ECM spécifique au tissu se produit au cours du développement, en raison des interactions complexes entre les cellules et leurs niches, influencées par divers stimuli intra et extracellulaires. L’ECM est une structure très dynamique qui subit des réarrangements chimiques et mécaniques de manière temporelle et spatiale et a un impact direct sur le destin cellulaire². L’une des caractéristiques les plus remarquables de l’ECM est sa diversité fonctionnelle, car chaque ECM tissulaire présente une combinaison unique de molécules qui fournissent différentes topologies et propriétés adaptées aux cellules qu’il contient¹.

La signalisation et le soutien de l’ECM sont cruciaux pour le développement et l’homéostasie et, lorsqu’ils sont perturbés, ils peuvent entraîner de multiples pathologies ^3,4. Un exemple est la dystrophie congénitale déficiente en LAMA2 (LAMA2-CMD), qui est la forme la plus courante de dystrophie musculaire congénitale. Le gène LAMA2 code pour la chaîne de laminine α2, qui est présente dans la laminine 211 et la laminine 221, et lorsqu’elle est mutée, peut conduire à LAMA2-CMD ⁵. La laminine 211 est la principale isoforme trouvée dans la membrane basale entourant les fibres musculaires squelettiques. Lorsque la laminine 211 est anormale ou absente, le lien entre la membrane basale et les cellules musculaires est perturbé, entraînant l’apparition de la maladie⁶. Les patients atteints de LAMA2-CMD présentent un phénotype léger à sévère en fonction du type de mutation dans le gène LAMA2.

Lorsque la fonction de la protéine laminine α2 est affectée, les patients peuvent présenter une hypotonie musculaire sévère à la naissance et développer une inflammation chronique, une fibrose et une atrophie musculaire, entraînant une réduction de l’espérance de vie. À ce jour, aucun traitement ciblé n’a été développé et les approches thérapeutiques se limitent à soulager les symptômes de la maladie⁷. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents impliqués dans l’apparition de cette maladie est cruciale pour développer des stratégies thérapeutiques appropriées ^6,8. Des travaux antérieurs utilisant la souris dy^{W 9}, un modèle pour LAMA2-CMD, suggèrent que l’apparition de la maladie commence in utero, en particulier pendant la myogenèse fœtale¹⁰. Une meilleure compréhension de la façon dont le défaut de myogenèse fœtale émerge changerait la donne dans la génération de nouvelles approches thérapeutiques pour LAMA2-CMD.

Les systèmes in vitro fournissent un environnement contrôlé pour étudier les interactions cellule-cellule et cellule-ECM, mais les modèles de culture 2D n’ont pas la complexité des tissus natifs. La décellularisation des tissus produit des échafaudages ECM acellulaires spécifiques aux tissus et aux stades de développement qui imitent plus précisément le microenvironnement cellulaire naturel par rapport aux modèles 2D et aux échafaudages artificiels / synthétiques. Les matrices décellularisées (dECM) ont le potentiel de préserver les signaux moléculaires et mécaniques du tissu hôte, ce qui en fait de meilleurs modèles alternatifs pour comprendre les processus in vivo ¹¹.

Il existe diverses techniques, réactifs et conditions qui peuvent être utilisés pour la décellularisation^12,13. Dans cette étude, un protocole de décellularisation pour le cœur de souris fœtale, décrit par Silva et al.14,15, est adapté au muscle squelettique de souris fœtale et conserve tous les composants ECM testés (laminine α2, laminines totales, fibronectine^, collagène I et collagène IV). Le protocole comprend trois étapes : la lyse cellulaire par choc osmotique (tampon hypotonique), la dissolution de la membrane plasmique et la dissociation des protéines (dodécylsulfate de sodium à 0,05 % [SDS]), et la destruction enzymatique de l’ADN (traitement par DNase). À notre connaissance, il s’agit du premier protocole établi pour décellulariser le muscle squelettique fœtal de souris.

Pour utiliser ce système 3D in vitro pour étudier LAMA2-CMD, il est crucial de maintenir la chaîne laminine α2 après décellularisation. Par conséquent, un protocole d’optimisation a été mis en œuvre où différents détergents (FDS et Triton X-100) et concentrations (0,02 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,2 % et 0,5 %) ont été testés (données non présentées). Le choix optimal pour l’élimination cellulaire et la préservation de la protéine laminine α2 s’est avéré être 0,05% SDS. Les cellules C2C12, une lignée cellulaire de myoblastes^16,17 bien établie^, ont été utilisées pour ensemencer les dECM. Ces cellules envahissent la dECM, prolifèrent et se différencient à l’intérieur de ces échafaudages, synthétisant de nouvelles protéines ECM. La production réussie de ce modèle in vitro 3D offre une nouvelle approche pour comprendre les processus moléculaires et cellulaires impliqués dans la myogenèse fœtale, l’apparition de LAMA2-CMD, et peut être étendue à d’autres maladies musculaires où la communication entre l’ECM et les cellules musculaires squelettiques est perturbée.