Summary

Подготовка 3D децеллюляризованных матриц из скелетных мышц плода мыши для культивирования клеток

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

В данной работе был оптимизирован протокол децеллюляризации для получения децеллюляризированных матриц скелетных мышц плода мыши. Миобласты C2C12 могут колонизировать эти матрицы, размножаться и дифференцироваться. Эта модель in vitro может быть использована для изучения поведения клеток в контексте заболеваний скелетных мышц, таких как мышечные дистрофии.

Abstract

Внеклеточный матрикс (ECM) играет решающую роль в обеспечении структурной поддержки клеток и передаче сигналов, которые важны для различных клеточных процессов. Двумерные (2D) модели клеточных культур чрезмерно упрощают сложные взаимодействия между клетками и ECM, поскольку отсутствие полной трехмерной (3D) поддержки может изменить поведение клеток, делая их неадекватными для понимания процессов in vivo . Недостатки в составе ECM и взаимодействиях между клетками и ECM являются важными факторами, способствующими множеству различных заболеваний.

Одним из примеров является врожденная мышечная дистрофия LAMA2 (LAMA2-CMD), при которой отсутствие или снижение функционального ламинина 211 и 221 может привести к тяжелой гипотонии, обнаруживаемой при рождении или вскоре после него. Предыдущая работа с использованием мышиной модели заболевания предполагает, что его начало происходит во время миогенеза плода. Настоящее исследование было направлено на разработку 3D-модели in vitro , позволяющей изучать взаимодействия между мышечными клетками и ECM мышц плода, имитируя нативное микроокружение. В этом протоколе используются глубокие мышцы спины, рассеченные из плодов мыши E18.5, обработанные гипотоническим буфером, анионным моющим средством и ДНКазой. Полученные децеллюляризованные матрицы (dECM) сохранили все протестированные белки ECM (ламинин α2, общие ламинины, фибронектин, коллаген I и коллаген IV) по сравнению с нативной тканью.

Когда миобласты C2C12 были посеяны поверх этих dECM, они проникли и колонизировали dECM, что поддерживало их пролиферацию и дифференцировку. Кроме того, клетки C2C12 продуцируют белки ECM, способствуя ремоделированию их ниши в dECM. Создание этой платформы in vitro обеспечивает новый многообещающий подход к разгадке процессов, связанных с возникновением LAMA2-CMD, и может быть адаптировано к другим заболеваниям скелетных мышц, где недостатки в коммуникации между ECM и клетками скелетных мышц способствуют прогрессированию заболевания.

Introduction

Внеклеточный матрикс (ECM) является основным компонентом тканей, представляя их неклеточный компонент. Эта трехмерная (3D) структура не только обеспечивает физическую поддержку клеток, но и играет решающую роль в биохимических процессах, участвующих в развитии организмов1. Формирование тканеспецифической ЭКМ происходит в процессе развития, в результате сложных взаимодействий между клетками и их нишами, на которые влияют различные внутри- и внеклеточные раздражители. ECM представляет собой высокодинамичную структуру, которая претерпевает химические и механические перестройки временно-пространственным образом и напрямую влияет на судьбу клетки2. Одной из наиболее примечательных характеристик ECM является его функциональное разнообразие, поскольку каждая тканевая ECM отображает уникальную комбинацию молекул, которые обеспечивают различные топологии и свойства, адаптированные к содержащимся в ней клеткам1.

Передача сигналов и поддержка ECM имеют решающее значение для развития и гомеостаза, и при нарушении могут привести к множественным патологическим состояниям 3,4. Одним из примеров является врожденная дистрофия с дефицитом LAMA2 (LAMA2-CMD), которая является наиболее распространенной формой врожденной мышечной дистрофии. Ген LAMA2 кодирует цепь ламинина α2, которая присутствует в ламинине 211 и ламинине 221, и при мутации может привести к LAMA2-CMD 5. Ламинин 211 является основной изоформой, обнаруженной в базальной мембране, окружающей волокна скелетных мышц. Когда ламинин 211 является аномальным или отсутствует, связь между базальной мембраной и мышечными клетками нарушается, что приводит к возникновению заболевания6. Пациенты с LAMA2-CMD демонстрируют фенотип от легкой до тяжелой степени в зависимости от типа мутации в гене LAMA2.

Когда нарушается функция белка ламинина α2, пациенты могут испытывать тяжелую мышечную гипотонию при рождении и развивать хроническое воспаление, фиброз и мышечную атрофию, что приводит к сокращению продолжительности жизни. На сегодняшний день не разработано таргетных методов лечения, а терапевтические подходы ограничиваются облегчением симптомов заболевания7. Таким образом, понимание основных молекулярных механизмов, участвующих в возникновении этого заболевания, имеет решающее значение для разработки соответствующих терапевтических стратегий 6,8. Предыдущая работа с использованием мыши dyW 9, модели для LAMA2-CMD, предполагает, что начало заболевания начинается в утробе матери, особенно во время миогенезаплода 10. Лучшее понимание того, как возникает дефект миогенеза плода, изменит правила игры в создании новых терапевтических подходов для LAMA2-CMD.

Системы in vitro обеспечивают контролируемую среду для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий, но 2D-моделям культур не хватает сложности нативных тканей. Децеллюляризация тканей производит тканеспецифические и стадия развития бесклеточные каркасы ECM, которые более точно имитируют естественное микроокружение клеток по сравнению с 2D-моделями и инженерными/синтетическими каркасами. Децеллюлярные матрицы (dECM) обладают потенциалом для сохранения молекулярных и механических сигналов ткани хозяина, что делает их лучшими альтернативными моделями для понимания процессов in vivo 11.

Существуют различные методы, реагенты и условия, которые могут быть использованы для децеллюляризации12,13. В этом исследовании протокол децеллюляризации сердца плода мыши, описанный Silva et al.14,15, адаптирован к скелетным мышцам плода мыши и, как было обнаружено, сохраняет все протестированные компоненты ECM (ламинин α2, общие ламинины, фибронектин, коллаген I и коллаген IV). Протокол включает три этапа: лизис клеток осмотическим шоком (гипотонический буфер), растворение плазматической мембраны и диссоциацию белка (0,05% додецилсульфата натрия [SDS]) и ферментативное разрушение ДНК (обработка ДНКазой). Насколько нам известно, это первый установленный протокол децеллюляризации скелетных мышц плода мыши.

Чтобы использовать эту 3D-систему in vitro для изучения LAMA2-CMD, крайне важно поддерживать цепь ламинина α2 после децеллюляризации. Поэтому был реализован протокол оптимизации, в котором тестировались различные моющие средства (SDS и Triton X-100) и концентрации (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% и 0,5%) (данные не показаны). Было обнаружено, что оптимальным выбором для удаления клеток и сохранения белка ламинина α2 является 0,05% SDS. Клетки C2C12, хорошо зарекомендовавшая себя линияклеток миобластов 16,17, были использованы для посева dECM. Эти клетки вторгаются в dECM, размножаются и дифференцируются внутри этих каркасов, синтезируя новые белки ECM. Успешное создание этой 3D-модели in vitro предлагает новый подход к пониманию молекулярных и клеточных процессов, участвующих в миогенезе плода, начале LAMA2-CMD, и может быть распространено на другие мышечные заболевания, при которых нарушается связь между ECM и клетками скелетных мышц.

Protocol

Все описанные методологии были одобрены Комитетом по благополучию животных (ORBEA) факультета естественных наук Лиссабонского университета и Direção Geral de Veterinária (DGAV; арт. 0421/000/000/2022) и соответствуют Европейской директиве 2010/63/ЕС. 1. Приготовление децеллюляризационных буфер…

Representative Results

Целью протокола децеллюляризации является получение dECM, которые очень похожи на состав нативной ткани. Для определения эффективности процесса децеллюляризации использовались различные методы, включая изучение морфологии тканей, измерение уровня ДНК, окрашивание на F-актин и анализ к…

Discussion

ECM представляет собой сложную сеть макромолекул, которая присутствует во всех тканях и играет решающую роль в регуляции поведения и функции клеток2. ECM действует как физический каркас для прикрепления клеток и обеспечивает сигналы, которые активно модулируют клеточные про…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Французской ассоциацией борьбы с миопатиями (AFM-Téléthon; контракт No 23049), проектом MATRIHEALTH и финансированием подразделения cE3c UIDB/00329/2020. Мы хотели бы поблагодарить нашего донора Энрике Мейреллеса, который решил поддержать проект MATRIHEALTH. В этой работе использовалась инфраструктура Центра микроскопии факультета естественных наук, узла Португальской платформы биовизуализации (ссылка PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), и мы благодарим Луиса Маркеса за его помощь в получении и обработке изображений. Наконец, мы благодарим Марту Пальму за техническую поддержку и нашу исследовательскую группу за их щедрый вклад.

Materials

12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Merck D8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21024
Bovine Serum Albumin, Fraction V NZYtech MB04601
BX60 fluorescence microscope Olympus
Cryostat CM1860 UV Leica
Dithiothreitol ThermoFisher R0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate Biowest L0103-500
DNase I PanReac AppliChem A3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck 108418
Fetal bovine serum Biowest S1560-500
Fine tip transfer pipette ThermoFisher 15387823
Goat serum Biowest S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet Heraeus
Heracell 150 CO2 Incubator Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein Standard Invitrogen
Horse Serum, New Zealand origin Gibco 16050122
HRP-α- Rabbit IgG abcam ab205718
HRP-α- Rat IgG abcam ab205720
HRP-α-Mouse IgG abcam ab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl Green Sigma-Aldrich 67060
MM400 Tissue Lyser Retsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar 043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSP GTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci. A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) Greiner Bio-One 628161
Qubit dsDNA HS kit Thermo Scientific Q32851
Qubit™ 3 Fluorometer Invitrogen 15387293
S6E Zoom Stereo microscope Leica
Sodium Dodecyl Sulfate Merck 11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slides Thermo Scientific 631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 15626144
TCS SPE confocal microscope Leica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% VWR Chemicals 28811.295
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) GRiSP GTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution) ThermoFisher 3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) Advansta L-08024-001
α-Collagen I abcam ab21286
α-Collagen IV Millipore AB756P
α-Collagen IV Santa Cruz Biotechnology sc-398655
α-Fibronectin Sigma F-3648
α-Laminin α2 Sigma L-0663
α-MHC D.S.H.B. MF20
α-Mouse Alexa 488 Molecular Probes A11017
α-Mouse Alexa 568 Molecular Probes A11019
α-pan-Laminin Sigma L- 9393
α-phospho-histone 3 Merk Millipore 06-570
α-Rabbit Alexa 568 Molecular Probes A21069
α-Rabbit Alexa 488 Molecular Probes A11070
α-Rat Alexa 488 Molecular Probes A11006

References

  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Play Video

Cite This Article
Gameiro dos Santos, P., Soares, A. R., Thorsteinsdóttir, S., Rodrigues, G. Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture. J. Vis. Exp. (193), e65069, doi:10.3791/65069 (2023).

View Video