Подготовка 3D децеллюляризованных матриц из скелетных мышц плода мыши для культивирования клеток

Внеклеточный матрикс (ECM) является основным компонентом тканей, представляя их неклеточный компонент. Эта трехмерная (3D) структура не только обеспечивает физическую поддержку клеток, но и играет решающую роль в биохимических процессах, участвующих в развитии организмов¹. Формирование тканеспецифической ЭКМ происходит в процессе развития, в результате сложных взаимодействий между клетками и их нишами, на которые влияют различные внутри- и внеклеточные раздражители. ECM представляет собой высокодинамичную структуру, которая претерпевает химические и механические перестройки временно-пространственным образом и напрямую влияет на судьбу клетки². Одной из наиболее примечательных характеристик ECM является его функциональное разнообразие, поскольку каждая тканевая ECM отображает уникальную комбинацию молекул, которые обеспечивают различные топологии и свойства, адаптированные к содержащимся в ней клеткам¹.

Передача сигналов и поддержка ECM имеют решающее значение для развития и гомеостаза, и при нарушении могут привести к множественным патологическим состояниям ^3,4. Одним из примеров является врожденная дистрофия с дефицитом LAMA2 (LAMA2-CMD), которая является наиболее распространенной формой врожденной мышечной дистрофии. Ген LAMA2 кодирует цепь ламинина α2, которая присутствует в ламинине 211 и ламинине 221, и при мутации может привести к LAMA2-CMD ⁵. Ламинин 211 является основной изоформой, обнаруженной в базальной мембране, окружающей волокна скелетных мышц. Когда ламинин 211 является аномальным или отсутствует, связь между базальной мембраной и мышечными клетками нарушается, что приводит к возникновению заболевания⁶. Пациенты с LAMA2-CMD демонстрируют фенотип от легкой до тяжелой степени в зависимости от типа мутации в гене LAMA2.

Когда нарушается функция белка ламинина α2, пациенты могут испытывать тяжелую мышечную гипотонию при рождении и развивать хроническое воспаление, фиброз и мышечную атрофию, что приводит к сокращению продолжительности жизни. На сегодняшний день не разработано таргетных методов лечения, а терапевтические подходы ограничиваются облегчением симптомов заболевания⁷. Таким образом, понимание основных молекулярных механизмов, участвующих в возникновении этого заболевания, имеет решающее значение для разработки соответствующих терапевтических стратегий ^6,8. Предыдущая работа с использованием мыши dy^{W 9}, модели для LAMA2-CMD, предполагает, что начало заболевания начинается в утробе матери, особенно во время миогенеза^{плода 10}. Лучшее понимание того, как возникает дефект миогенеза плода, изменит правила игры в создании новых терапевтических подходов для LAMA2-CMD.

Системы in vitro обеспечивают контролируемую среду для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий, но 2D-моделям культур не хватает сложности нативных тканей. Децеллюляризация тканей производит тканеспецифические и стадия развития бесклеточные каркасы ECM, которые более точно имитируют естественное микроокружение клеток по сравнению с 2D-моделями и инженерными/синтетическими каркасами. Децеллюлярные матрицы (dECM) обладают потенциалом для сохранения молекулярных и механических сигналов ткани хозяина, что делает их лучшими альтернативными моделями для понимания процессов in vivo ¹¹.

Существуют различные методы, реагенты и условия, которые могут быть использованы для децеллюляризации^12,13. В этом исследовании протокол децеллюляризации сердца плода мыши, описанный Silva et al.14,15, адаптирован к скелетным мышцам плода мыши и, как было обнаружено, сохраняет все протестированные компоненты ECM (ламинин α2, общие ламинины, фибронектин^, коллаген I и коллаген IV). Протокол включает три этапа: лизис клеток осмотическим шоком (гипотонический буфер), растворение плазматической мембраны и диссоциацию белка (0,05% додецилсульфата натрия [SDS]) и ферментативное разрушение ДНК (обработка ДНКазой). Насколько нам известно, это первый установленный протокол децеллюляризации скелетных мышц плода мыши.

Чтобы использовать эту 3D-систему in vitro для изучения LAMA2-CMD, крайне важно поддерживать цепь ламинина α2 после децеллюляризации. Поэтому был реализован протокол оптимизации, в котором тестировались различные моющие средства (SDS и Triton X-100) и концентрации (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% и 0,5%) (данные не показаны). Было обнаружено, что оптимальным выбором для удаления клеток и сохранения белка ламинина α2 является 0,05% SDS. Клетки C2C12, хорошо зарекомендовавшая себя линия^{клеток миобластов 16,17,} были использованы для посева dECM. Эти клетки вторгаются в dECM, размножаются и дифференцируются внутри этих каркасов, синтезируя новые белки ECM. Успешное создание этой 3D-модели in vitro предлагает новый подход к пониманию молекулярных и клеточных процессов, участвующих в миогенезе плода, начале LAMA2-CMD, и может быть распространено на другие мышечные заболевания, при которых нарушается связь между ECM и клетками скелетных мышц.