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Quantificação e caracterização do genoma completo do RNA do SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais e ar

Published: June 30, 2023
doi:
10.3791/65053
, , , , , , , , ,
1Institute of Sustainable Processes,University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology,University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology,National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS – School of Medicine and Biomedical Sciences,Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit),Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Este protocolo visa quantificar o ARN SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais e ar a serem usadas para estudos epidemiológicos baseados em águas residuais e avaliar o risco de exposição ao SARS-CoV-2 em aerossóis interiores e exteriores. Este protocolo igualmente descreve uma aproximação do sequenciamento longo do modelo do amplicon tiled para a caracterização do genoma inteiro SARS-CoV-2.

Abstract

A epidemiologia baseada em águas residuais emergiu como um sistema de vigilância promissor e eficaz para SARS-CoV-2 e outras doenças infecciosas em muitas nações. O processo tipicamente envolve concentração de águas residuais, extração de ácidos nucleicos, amplificação de segmentos genômicos selecionados e detecção e quantificação do segmento genômico amplificado. Esta metodologia pode igualmente ser aproveitada para detectar e quantificar agentes infecciosos, tais como SARS-CoV-2, em amostras de ar. Inicialmente, presumia-se que o SARS-CoV-2 se espalhasse principalmente por meio do contato pessoal próximo com gotículas geradas por um indivíduo infectado enquanto falava, espirrava, tossia, cantava ou respirava. No entanto, um número crescente de estudos relatou a presença de RNA do SARS-CoV-2 no ar de instalações de saúde, estabelecendo a transmissão por via aérea como uma rota viável para o vírus. Este estudo apresenta um composto de protocolos estabelecidos para facilitar a detecção, quantificação e sequenciamento ambiental de vírus de amostras de águas residuárias e ar.

Introduction

Em dezembro de 2019, surgiu uma nova doença chamada COVID-19, causada por um coronavírus até então desconhecido, o SARS-CoV-21. A pandemia global resultante apresentou um desafio significativo para os laboratórios clínicos e de saúde pública em todo o mundo, já que um grande número de indivíduos requer testes para avaliar com precisão a transmissão e a prevalência do vírus na comunidade. No entanto, em muitas regiões, alcançar o nível necessário de testagem em tempo hábil e espacialmente abrangente é economicamente inviável 2,3. Os sistemas de vigilância atuais, baseados em diagnósticos clínicos individuais, dependem fortemente da gravidade dos sintomas e da notificação individual, bem como do grau em que esses sintomas se sobrepõem às doenças existentes circulantes na população4,5,6,7,8,9,10. Consequentemente, um número elevado de casos assintomáticos contribui para uma subestimação significativa da carga da doença7,11.

Devido a esses desafios, a epidemiologia baseada em águas residuais (WBE) para a vigilância COVID-19 foi proposta como uma estratégia de vigilância complementar. A EFC foi descrita pela primeira vez em 200112 e foi inicialmente utilizada para rastrear cocaína e outras drogas ilícitas13. Essa abordagem baseia-se no pressuposto de que é possível calcular a concentração inicial de qualquer substância estável em águas residuárias e excretada pelo ser humano 8,12. O WBE tem sido implementado com sucesso em muitos países como um sistema de vigilância complementar e eficiente para SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. A maioria dos métodos para detecção de vírus humanos em ambientes aquáticos segue estas etapas: concentração, extração de ácidos nucleicos, amplificação do segmento (ou segmentos) genômico escolhido e detecção/quantificação do segmento genômico amplificado3.

Outro ambiente importante para a detecção e quantificação do SARS-CoV-2 está em amostras de ar. Inicialmente, acreditava-se que o SARS-CoV-2 era transmitido principalmente por meio do contato pessoal próximo com gotículas respiratórias de aerossóis gerados por uma pessoa infectada enquanto falava, espirrava, tossia, cantava ou respirava17. No entanto, vários estudos começaram a relatar a presença do RNA do SARS-CoV-2 no ar, especialmente em estabelecimentos de saúde e outros espaços fechados 18,19,20,21. Evidências de viabilidade do SARS-CoV-2 em amostras de ar coletadas em ambientes fechados em hospitais e outros espaços fechados foram encontradas quando a concentração do vírus era suficientemente alta22,23,2 4. Estudos ao ar livre geralmente não encontraram evidências de SARS-CoV-2, exceto em espaços ao ar livre lotados 21,25,26,27,28,29. A partir de agora, a transmissão aérea do SARS-CoV-2 foi reconhecida como um modo de transmissão30,31. Um estudo de revisão recente mostra as diferenças entre ambientes externos, onde os riscos de transmissão pelo ar são mínimos fora de áreas lotadas, e em ambientes fechados, onde riscos maiores podem estar presentes em ambientes mal ventilados nos quais fontes fortes (ou seja, número de pessoas infectadas) podem estar presentes. Um recente estudo de revisão abrangente destacou as diferenças substanciais entre os riscos de transmissão pelo ar em ambientes externos versus internos, particularmente em áreas lotadas com ventilação deficiente. O estudo indica que o risco de transmissão pelo ar é mínimo em ambientes externos, onde há maior volume de ar disponível para diluição e dispersão de partículas virais32. Estes resultados têm implicações importantes para as políticas de saúde pública e directrizes relacionadas com COVID-19. Ao reconhecer as diferenças significativas nos riscos de transmissão entre ambientes internos e externos, os formuladores de políticas podem desenvolver estratégias mais eficazes para mitigar a propagação do vírus e proteger a saúde pública.

Há uma variedade de métodos e protocolos para a detecção, quantificação e sequenciamento de SARS-CoV-2 de diferentes amostras ambientais. Este artigo de método tem como objetivo apresentar uma combinação de protocolos bem estabelecidos que permitem que laboratórios com diferentes níveis de capacidade realizem detecção, quantificação e sequenciamento ambiental de vírus a partir de amostras de águas residuárias e ar.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram publicados em outros lugares e contêm pequenas modificações dos métodos originais. 1. Coleta de águas residuais e pré-processamento de amostras NOTA: Devido às baixas concentrações de RNA do SARS-CoV-2 em amostras ambientais, a implementação de uma etapa de concentração é crucial para uma detecção bem-sucedida33,34,35<sup class=…

Representative Results

Os resultados resumidos na Tabela 3 mostram exemplos da detecção e quantificação do RNA do SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais e ar usando o método descrito neste artigo. Amostras de águas residuárias foram coletadas de estações de tratamento de águas residuais na Espanha e na Eslovênia e foram consideradas positivas se a Ct fosse inferior a 40 em pelo menos duas das três repetições, sendo a quantificação considerada válida se a Ct tivesse uma variação inferior a 5%. Em Espanha …

Discussion

A detecção e quantificação microbiana e viral usando métodos de (RT-)qPCR têm obtido ampla aceitação devido à sua notável sensibilidade. No entanto, essas técnicas enfrentam inúmeros desafios ao analisar amostras ambientais. As amostras de águas residuais contêm uma abundância de substâncias inibidoras que podem distorcer as medições e gerar resultados enganosos. Para enfrentar essas limitações e aumentar a precisão, um protocolo complexo foi concebido, projetado e implementado. Este protocolo foi ad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi realizado com apoio financeiro do Governo Regional de Castela e Leão e do programa FEDER (projetos CLU 2017-09, UIC315 e VA266P20).

Materials

Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit
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References

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Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).
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