JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
italiano

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Quantificazione e caratterizzazione dell'intero genoma dell'RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria

Published: June 30, 2023
doi:
10.3791/65053
, , , , , , , , ,
1Institute of Sustainable Processes,University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology,University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology,National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS – School of Medicine and Biomedical Sciences,Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit),Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Questo protocollo mira a quantificare l’RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria da utilizzare per studi epidemiologici basati sulle acque reflue e a valutare il rischio di esposizione a SARS-CoV-2 in aerosol interni ed esterni. Questo protocollo descrive anche un approccio di sequenziamento a modello lungo dell’amplicone piastrellato per la caratterizzazione dell’intero genoma di SARS-CoV-2.

Abstract

L’epidemiologia basata sulle acque reflue è emersa come un sistema di sorveglianza promettente ed efficace per SARS-CoV-2 e altre malattie infettive in molte nazioni. Il processo prevede in genere la concentrazione delle acque reflue, l’estrazione dell’acido nucleico, l’amplificazione di segmenti genomici selezionati e il rilevamento e la quantificazione del segmento genomico amplificato. Allo stesso modo, questa metodologia può essere sfruttata per rilevare e quantificare agenti infettivi, come il SARS-CoV-2, nei campioni d’aria. Inizialmente, si presumeva che il SARS-CoV-2 si diffondesse principalmente attraverso uno stretto contatto personale con le goccioline generate da un individuo infetto mentre parlava, starnutiva, tossiva, cantava o respirava. Tuttavia, un numero crescente di studi ha riportato la presenza di RNA SARS-CoV-2 nell’aria delle strutture sanitarie, stabilendo che la trasmissione per via aerea è una via praticabile per il virus. Questo studio presenta un insieme di protocolli consolidati per facilitare il rilevamento, la quantificazione e il sequenziamento ambientale dei virus sia dalle acque reflue che dai campioni d’aria.

Introduction

Nel dicembre 2019 è emersa una nuova malattia chiamata COVID-19, causata da un coronavirus precedentemente sconosciuto, SARS-CoV-21. La pandemia globale che ne è derivata ha rappresentato una sfida significativa per i laboratori clinici e di salute pubblica in tutto il mondo, poiché un gran numero di persone richiede test per valutare con precisione la trasmissione e la prevalenza del virus nella comunità. Tuttavia, in molte regioni, raggiungere il livello necessario di test in modo tempestivo e spazialmente completoè economicamente irrealizzabile 2,3. Gli attuali sistemi di sorveglianza basati sulla diagnostica clinica individuale si basano fortemente sulla gravità dei sintomi e sulla segnalazione individuale, nonché sulla misura in cui questi sintomi si sovrappongono alle malattie esistenti che circolano nella popolazione 4,5,6,7,8,9,10. Di conseguenza, un numero elevato di casi asintomatici contribuisce a una significativa sottostima del carico di malattia 7,11.

A causa di queste sfide, l’epidemiologia basata sulle acque reflue (WBE) per la sorveglianza COVID-19 è stata proposta come strategia di sorveglianza complementare. Il WBE è stato descritto per la prima volta nel 200112 ed è stato inizialmente utilizzato per rintracciare la cocaina e altre droghe illegali13. Questo approccio si basa sul presupposto che sia possibile calcolare la concentrazione iniziale di qualsiasi sostanza stabile nelle acque reflue ed escreta dall’uomo 8,12. WBE è stato implementato con successo in molti paesi come sistema di sorveglianza complementare ed efficiente per SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. La maggior parte dei metodi per rilevare i virus umani in ambienti acquatici segue queste fasi: concentrazione, estrazione dell’acido nucleico, amplificazione del segmento genomico (o dei segmenti) scelti e rilevamento/quantificazione del segmento genomico amplificato3.

Un altro ambiente importante per il rilevamento e la quantificazione del SARS-CoV-2 è quello dei campioni d’aria. Inizialmente, si pensava che il SARS-CoV-2 si trasmettesse principalmente attraverso uno stretto contatto personale con le goccioline respiratorie degli aerosol generati da una persona infetta mentre parlava, starnutiva, tossiva, cantava o respirava17. Tuttavia, diversi studi hanno iniziato a segnalare la presenza di RNA SARS-CoV-2 nell’aria, in particolare nelle strutture sanitarie e in altri spazi chiusi 18,19,20,21. È stata riscontrata la fattibilità del SARS-CoV-2 in campioni d’aria prelevati al chiuso negli ospedali e in altri spazi chiusi quando la concentrazione del virus era sufficientemente alta22,23,2 4. Gli studi all’aperto non hanno generalmente trovato prove di SARS-CoV-2, tranne che in spazi esterni affollati 21,25,26,27,28,29. A partire da ora, la trasmissione aerea di SARS-CoV-2 è stata riconosciuta come modalità di trasmissione30,31. Un recente studio di revisione mostra le differenze tra l’esterno, dove i rischi di trasmissione per via aerea sono minimi al di fuori delle aree affollate, e l’interno, dove i rischi maggiori potrebbero essere presenti in ambienti scarsamente ventilati in cui potrebbero essere presenti forti fonti (cioè il numero di persone infette). Un recente studio di revisione completo ha evidenziato le differenze sostanziali tra i rischi di trasmissione per via aerea in ambienti esterni rispetto a quelli interni, in particolare in aree affollate con scarsa ventilazione. Lo studio indica che il rischio di trasmissione per via aerea è minimo negli ambienti esterni, dove c’è un volume maggiore di aria disponibile per la diluizione e la dispersione delle particelle virali32. Questi risultati hanno importanti implicazioni per le politiche e le linee guida di salute pubblica relative al COVID-19. Riconoscendo le differenze significative nei rischi di trasmissione tra ambienti interni ed esterni, i responsabili politici possono sviluppare strategie più efficaci per mitigare la diffusione del virus e proteggere la salute pubblica.

Esistono diversi metodi e protocolli per il rilevamento, la quantificazione e il sequenziamento di SARS-CoV-2 da diversi campioni ambientali. Questo articolo sul metodo mira a presentare una combinazione di protocolli consolidati che consentono ai laboratori con diversi livelli di capacità di eseguire il rilevamento, la quantificazione e il sequenziamento ambientale di virus da acque reflue e campioni d’aria.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati pubblicati altrove e contengono piccole modifiche rispetto ai metodi originali. 1. Raccolta delle acque reflue e pre-trattamento dei campioni NOTA: A causa delle basse concentrazioni di RNA SARS-CoV-2 nei campioni ambientali, l’implementazione di una fase di concentrazione è fondamentale per una rilevazione di successo33,34,35<sup class="xref…

Representative Results

I risultati riassunti nella Tabella 3 mostrano esempi di rilevamento e quantificazione dell’RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria utilizzando il metodo descritto in questo articolo. I campioni di acque reflue sono stati raccolti da impianti di trattamento delle acque reflue in Spagna e Slovenia e sono stati considerati positivi se il Ct era inferiore a 40 in almeno due delle tre repliche, con quantificazione considerata valida se il Ct aveva una variazione inferiore al 5%. In Spagna e Port…

Discussion

Il rilevamento e la quantificazione microbici e virali mediante metodi (RT-)qPCR hanno ottenuto un’ampia accettazione grazie alla loro notevole sensibilità. Tuttavia, queste tecniche devono affrontare numerose sfide durante l’analisi dei campioni ambientali. I campioni di acque reflue contengono un’abbondanza di sostanze inibitorie che possono distorcere le misurazioni e generare risultati fuorvianti. Per affrontare queste limitazioni e migliorare la precisione, è stato concepito, progettato e implementato un protocoll…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato eseguito con il sostegno finanziario del governo regionale di Castilla y León e del programma FEDER (progetti CLU 2017-09, UIC315 e VA266P20).

Materials

Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease (2020)
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020)
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission – A brief review. One Health. 15, 100405 (2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094 (2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226 (2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180 (2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 – approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404 (2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558 (2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14 (2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. d. e. L., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251 (2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787 (2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540 (2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955 (2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200 (2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352 (2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732 (2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255 (2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326 (2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599 (2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932 (2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021)
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021)
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137 (2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC – 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020)
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020)
  40. Tyson, J. R. . Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. . ARTIC SARS-CoV-2 Workflow Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022)
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. . Freyja Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022)
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773 (2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215 (2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942 (2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557 (2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926 (2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764 (2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002 (2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods – A scoping review. Water Research. 179, 115899 (2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614 (2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776 (2020).
  60. . VATar COVID-19 | Caso de Exito – Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022)
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098 (2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202 (2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574 (2023).
  64. Gonçalves, J., et al. . Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Tags

Wastewater-based EpidemiologySARS-CoV-2COVID-19Air SamplingViral RNART-qPCRMengovirusN1 GeneN2 GeneRNA ExtractionCentrifugal UltrafiltrationComposite Wastewater SampleMolecular Biology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image