Estimulação Multimodal Automatizada e Gravação Neuronal Simultânea de Múltiplos Pequenos Organismos

Técnicas de imagem com cálcio têm permitido o registro não invasivo da dinâmica neural in vivo em tempo real utilizando microscopia de fluorescência e indicadores de cálcio codificados geneticamente, expressos em células-alvo ^1,2,3. Esses sensores normalmente usam uma proteína fluorescente verde (GFP), como a família do peptídeo GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar a intensidade da fluorescência após a ativação neuronal e níveis elevados de cálcio intracelular. A imagem do cálcio tem sido especialmente poderosa no nematoide C. elegans para examinar como neurônios e circuitos neurais funcionam em animais vivos e comportados 4,5,6,7,8,9,10, pois sua natureza transparente significa que nenhum processo cirúrgico é necessário para o acesso óptico^{, e} promotores gênicos específicos de células têm como alvo a expressão para as células de interesse. Essas técnicas frequentemente utilizam dispositivos microfluídicos, que fornecem ambientes precisamente controlados para estudar fenômenos biológicos, químicos e físicos em pequena escala física^11,12. Dispositivos microfluídicos são abundantes para medir a atividade neural, com novos projetos continuamente em desenvolvimento, e eles são prontamente fabricados no laboratório de pesquisa. No entanto, muitos delineamentos aprisionam um único animal de cada vez, limitando o rendimento experimental ^7,9,13. As respostas neurais geralmente variam substancialmente entre os animais devido a diferenças na experiência anterior, estados internos, como estresse ou fome, ou fatores estocásticos, como níveis de expressão gênica. Essas diferenças estabelecem a necessidade de métodos que possam simultaneamente estimular e observar muitos animais e extrair informações dos^indivíduos4.

Além disso, certos fenômenos neuromodulatórios tornam-se aparentes apenas sob condições específicas de estimulação, como a inibição temporal¹⁴, que se refere à supressão breve das respostas quando a estimulação ocorre em rápida sucessão. Sistemas eletrofisiológicos podem conduzir a atividade neural através de um amplo espaço de estímulo para esse fim, modulando, por exemplo, a corrente de pulso elétrico, tensão, frequência, forma de onda, ciclo de trabalho e tempo de trens de estímulos periódicos. A estimulação indireta por estímulos naturalmente detectados ou sistemas optogenéticos se beneficiaria de uma amplitude semelhante de mecanismos de controle. Atualmente, muitos estímulos naturais são apresentados de forma simples “on-off”, como apresentação e remoção de odores, utilizando sistemas comerciais que têm demorado a agregar flexibilidade. No entanto, microcontroladores de baixo custo agora podem automatizar a entrega de vários tipos de estímulos de uma maneira personalizável às necessidades dos pesquisadores. Combinados com a microfluídica, esses sistemas alcançaram o objetivo de aumentar o rendimento experimental e a flexibilidade, permitindo que respostas neurais a uma variedade de estímulos precisos fossem medidas simultaneamente em muitos animais ^4,6. A estimulação multimodal pode ser usada para interrogar ainda mais os circuitos neuronais, como por exemplo, monitorando mudanças na excitabilidade neural ao estimular consistentemente antes, durante e após uma perturbação ortogonal, como a exposição a drogas⁴. Os benefícios de sistemas de microscopia abertos e de baixo custo são claros para o avanço da pesquisa científica, mas, na prática, a necessidade de fornecimento de peças, construção e validação de desempenho pode impedir a adoção dessas técnicas.

Este protocolo visa atenuar alguns destes desafios técnicos. Considerando que protocolos anteriores enfocaram o uso de dispositivos microfluídicos e estimulação básica 9,15,17^, descrevemos aqui a construção e o uso de um sistema flexível, automatizado e multimodal de liberação de estímulos para imagens neurais em C. elegans ou outros pequenos organismos utilizando dispositivos microfluídicos previamente descritos⁴. O sistema de código aberto é programado através de arquivos de texto simples para definir os experimentos, e o programa de análise de dados NeuroTracker extrai semi-automaticamente os dados de atividade neural dos vídeos do microscópio. Demonstramos esse sistema com exemplos de avaliação de inibição temporal, desinibição e crosstalk de estímulos utilizando o neurônio quimiossensorial AWA, que se despolariza em resposta a diferentes odores alimentares ou em resposta à luz ao expressar canais iônicos optogenéticos sensíveis à luz ^5,6.