Автоматизированная мультимодальная стимуляция и одновременная запись нейронов от нескольких мелких организмов

Методы визуализации кальция позволили неинвазивно регистрировать нейронную динамику in vivo в режиме реального времени с использованием флуоресцентной микроскопии и генетически кодируемых кальциевых индикаторов, экспрессируемых в клетках-мишенях ^1,2,3. Эти датчики обычно используют зеленый флуоресцентный белок (GFP), такой как семейство пептидов GFP-кальмодулин-M13 (GCaMP), для увеличения интенсивности флуоресценции при активации нейронов и повышении внутриклеточного уровня кальция. Визуализация кальция была особенно мощной у нематоды C. elegans для изучения того, как функционируют нейроны и нейронные цепи у живых, ведущих себя животных 4,5,6,7,8,9,10, поскольку их прозрачная природа означает, что для оптического доступа не требуется хирургического процесса, а промоторы генов, специфичные для клеток^, нацелены на экспрессию в интересующие клетки. В этих методах часто используются микрофлюидные устройства, которые обеспечивают точно контролируемую среду для изучения биологических, химических и физических явлений в небольшом физическом масштабе^11,12. Микрофлюидные устройства изобилуют для измерения нейронной активности, с новыми конструкциями, постоянно разрабатываемыми, и они легко изготавливаются в исследовательской лаборатории. Однако многие конструкции ловят по одному животному за раз, ограничивая экспериментальную пропускную способность ^7,9,13. Нейронные реакции часто существенно различаются у разных животных из-за различий в предыдущем опыте, внутренних состояниях, таких как стресс или голод, или стохастических факторах, таких как уровни экспрессии генов. Эти различия устанавливают потребность в методах, которые могут одновременно стимулировать и наблюдать за многими животными и извлекать информацию из особей⁴.

Кроме того, некоторые нейромодулирующие явления становятся очевидными только при определенных условиях стимуляции, таких как временное торможение¹⁴, которое относится к кратковременному подавлению реакций, когда стимуляция происходит в быстрой последовательности. Для этой цели электрофизиологические системы могут управлять нейронной активностью в широком пространстве стимулов, модулируя, например, электрический импульсный ток, напряжение, частоту, форму волны, рабочий цикл и время периодических поездов стимулов. Косвенная стимуляция естественно обнаруженными стимулами или оптогенетическими системами выиграет от аналогичной широты механизмов контроля. В настоящее время многие естественные стимулы представлены простым способом «включения-выключения», такими как представление и удаление запаха, с использованием коммерческих систем, которые медленно добавляли гибкость. Тем не менее, недорогие микроконтроллеры теперь могут автоматизировать доставку нескольких типов стимулов таким образом, чтобы их можно было настроить в соответствии с потребностями исследователей. В сочетании с микрофлюидикой эти системы достигли цели увеличения экспериментальной пропускной способности и гибкости, что позволило одновременно измерять нейронные реакции на различные точные стимулы у многих животных ^4,6. Мультимодальная стимуляция может быть использована для дальнейшего опроса нейронных схем, например, путем мониторинга изменений нервной возбудимости при последовательной стимуляции до, во время и после ортогонального возмущения, такого как воздействие лекарственного средства⁴. Преимущества недорогих открытых микроскопических систем очевидны для продвижения научных исследований, но на практике потребность в поиске деталей, изготовлении и проверке производительности может препятствовать внедрению этих методов.

Этот протокол направлен на смягчение некоторых из этих технических проблем. В то время как предыдущие протоколы были сосредоточены на использовании микрофлюидных устройств и базовой стимуляции 9,15,17, мы описываем здесь построение и использование гибкой, автоматизированной^, мультимодальной системы доставки стимулов для нейронной визуализации у C. elegans или других малых организмов с использованием ранее описанных микрофлюидных устройств 4. Система с открытым исходным кодом запрограммирована с помощью простых текстовых файлов для определения экспериментов, а программа анализа данных NeuroTracker полуавтоматически извлекает данные о нейронной активности из видео микроскопа. Мы демонстрируем эту систему на примерах оценки временного торможения, растормаживания и перекрестных помех стимулов с использованием хемосенсорного нейрона AWA, который деполяризуется в ответ на различные запахи пищи или в ответ на свет при экспрессии оптогенетических светочувствительных ионных каналов ^5,6.