ATAC-Seq الخاص بالخلايا الشحمية مع الأنسجة الدهنية باستخدام فرز النواة المنشطة بالفلورة
Summary
نقدم بروتوكولا لفحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) على وجه التحديد على الخلايا الشحمية باستخدام فرز النواة مع الأنسجة الدهنية المعزولة من الفئران المراسلة المعدلة وراثيا مع وضع العلامات الفلورية النووية.
Abstract
يعد فحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع التسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) تقنية قوية تتيح تنميط إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مستوى الجينوم. كانت هذه التقنية مفيدة لفهم الآليات التنظيمية للتعبير الجيني في مجموعة من العمليات البيولوجية. على الرغم من تعديل ATAC-seq لأنواع مختلفة من العينات ، لم تكن هناك تعديلات فعالة لطرق ATAC-seq للأنسجة الدهنية. تشمل التحديات التي تواجه الأنسجة الدهنية عدم التجانس الخلوي المعقد ، ومحتوى الدهون الكبير ، والتلوث العالي للميتوكوندريا. للتغلب على هذه المشاكل ، قمنا بتطوير بروتوكول يسمح ب ATAC-seq الخاص بالخلايا الشحمية من خلال استخدام فرز النواة المنشطة بالفلورة مع الأنسجة الدهنية من المراسل المعدل وراثيا وضع العلامات النووية وترجمة فأر تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP). ينتج هذا البروتوكول بيانات عالية الجودة مع الحد الأدنى من قراءات التسلسل المهدرة مع تقليل كمية مدخلات النواة والكواشف. تقدم هذه الورقة إرشادات مفصلة خطوة بخطوة لطريقة ATAC-seq التي تم التحقق من صحتها لاستخدام نوى الخلايا الشحمية المعزولة من الأنسجة الدهنية للفئران. سيساعد هذا البروتوكول في التحقيق في ديناميكيات الكروماتين في الخلايا الشحمية عند المحفزات البيولوجية المتنوعة ، مما سيسمح برؤى بيولوجية جديدة.
Introduction
الأنسجة الدهنية ، المتخصصة في تخزين الطاقة الزائدة في شكل جزيئات دهنية ، هي عضو رئيسي لتنظيم التمثيل الغذائي. يعد التحكم الصارم في تكوين الخلايا الشحمية وصيانتها أمرا حيويا لوظيفة الأنسجة الدهنية وتوازن طاقة الجسم بالكامل1. تلعب العديد من منظمات النسخ دورا مهما في التحكم في تمايز الخلايا الشحمية واللدونة والوظيفة. بعض هذه المنظمات متورطة في اضطرابات التمثيل الغذائي لدى البشر 2,3. سهلت التطورات الحديثة في تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية للتعبير الجيني والتحليل فوق الجيني اكتشاف المنظمين الجزيئيين لبيولوجيا الخلايا الشحمية4. من الصعب إجراء دراسات التنميط الجزيئي باستخدام الأنسجة الدهنية بسبب عدم تجانس هذه الأنسجة. تتكون الأنسجة الدهنية بشكل أساسي من الخلايا الشحمية ، المسؤولة عن تخزين الدهون ، ولكنها تحتوي أيضا على أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية والخلايا المناعية5. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغيير التركيب الخلوي للأنسجة الدهنية بشكل كبير استجابة للتغيرات الفيزيولوجية المرضية مثل درجة الحرارة والحالة التغذوية6. للتغلب على هذه المشاكل ، قمنا سابقا بتطوير فأر مراسل معدل وراثيا ، يسمى الوسم النووي وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP) ، والذي ينتج الريبوسومات الموسومة ب GFP ونوى البيوتينيل الموسومة ب mCherry بطريقة تعتمد على Crerecombinase 7. يمكن نظام وضع العلامات المزدوجة المرء من إجراء تحليل نسخي وفوق جيني خاص بنوع الخلية مع الأنسجة. باستخدام فئران NuTRAP المتقاطعة مع خطوط adiponectin-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية (Adipoq-NuTRAP) ، قمنا سابقا بتمييز ملفات تعريف التعبير الجيني وحالات الكروماتين من مجموعات الخلايا الدهنية النقية في الجسم الحي وحددنا كيفية تغييرها أثناء السمنة 7,8. في السابق ، عبرت الفئران NuTRAP مع خطوط Ucp1-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية البنية والبيج (Ucp1-NuTRAP) سمحت لنا بتوصيف إعادة تشكيل epigenomic لسكان الخلايا الدهنية الحرارية النادرة ، الخلايا الشحمية البيج ، استجابة للتغيرات في درجات الحرارة9.
ATAC-seq هي طريقة تحليلية مستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مستوى الجينوم. يسمح ترانسبوزاز Tn5 شديد التفاعل المستخدم في ATAC-seq بتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة عن طريق وضع علامات على محولات التسلسل في المنطقة التي يمكن الوصول إليها من الكروماتين في النوى10. ATAC-seq هي طريقة بسيطة ، لكنها توفر نتائج قوية وكفاءة عالية حتى مع عينات منخفضة المدخلات. وبالتالي ، فقد أصبحت واحدة من أكثر طرق التنميط فوق الجيني شيوعا وساهمت في فهم الآليات التنظيمية للتعبير الجيني في سياقات بيولوجية متنوعة. منذ إنشاء بروتوكول ATAC-seq الأصلي ، تم تطوير العديد من التقنيات المشتقة من ATAC لتعديل وتحسين البروتوكول لأنواع مختلفة من العينات. على سبيل المثال ، تم تصميم Fast-ATAC لتحليل عينات خلايا الدم11 ، و Omni-ATAC هو بروتوكول محسن لعينات الأنسجة المجمدة12 ، و MiniATAC-seq فعال لتحليل الأجنة في المراحل المبكرة13. ومع ذلك ، فإن تطبيق طريقة ATAC-seq على الخلايا الشحمية ، وخاصة من عينات الأنسجة ، لا يزال يمثل تحديا. بالإضافة إلى عدم تجانس الأنسجة الدهنية ، قد يتداخل محتواها العالي من الدهون مع تفاعلات إعادة التركيب الفعالة بواسطة ترانسبوزاز Tn5 حتى بعد عزل النواة. علاوة على ذلك ، فإن المحتوى العالي من الميتوكوندريا في الخلايا الشحمية ، خاصة في الخلايا الشحمية البنية والبيج ، يسبب تلوثا عاليا للحمض النووي للميتوكوندريا وقراءات تسلسل مهدرة. تصف هذه الورقة بروتوكولا ل ATAC-seq الخاص بالخلايا الشحمية باستخدام فئران Adipoq-NuTRAP (الشكل 1). من خلال الاستفادة من فرز النواة المسمى بالفلورة ، يسمح هذا البروتوكول بجمع مجموعات نقية من نوى الخلايا الشحمية بعيدا عن أنواع الخلايا المربكة الأخرى والإزالة الفعالة للدهون والميتوكوندريا وحطام الأنسجة. وبالتالي ، يمكن لهذا البروتوكول إنشاء بيانات عالية الجودة خاصة بنوع الخلية وتقليل النفايات من قراءات الميتوكوندريا أثناء استخدام كمية أقل من المدخلات والكواشف مقارنة بالبروتوكول القياسي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة ، قدمنا بروتوكول ATAC-seq محسن لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين الخاص بالخلايا الشحمية في الجسم الحي. نجح بروتوكول ATAC-seq هذا باستخدام ماوس Adipoq-NuTRAP في إنشاء ملفات تعريف إمكانية الوصول إلى الكروماتين الخاصة بالخلايا الشحمية. العامل الأكثر أهمية لتجارب ATAC-seq الناجحة والقا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل الصندوق الاستئماني لأبحاث IUSM Showalter (إلى HCR) ، وهو مركز IUSM لمرض السكري وأمراض التمثيل الغذائي التجريبي ومنحة الجدوى (إلى HCR) ، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R01DK129289 إلى HCR) ، وجائزة أعضاء هيئة التدريس المبتدئين لجمعية السكري الأمريكية (7-21-JDF-056 إلى HCR).
Materials
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin’s hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
