Summary

Floresan Aktif Çekirdek Ayıklama Kullanarak Yağ Dokuları ile Adiposit-Spesifik ATAC-Seq

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

Nükleer floresan etiketlemeli transgenik muhabir farelerden izole edilen yağ dokuları ile çekirdek sıralama kullanarak özellikle adipositler üzerinde yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için bir test protokolü sunuyoruz.

Abstract

Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için test, genom çapında kromatin erişilebilirlik profillemesini sağlayan sağlam bir tekniktir. Bu teknik, bir dizi biyolojik süreçte gen ekspresyonunun düzenleyici mekanizmalarını anlamak için yararlı olmuştur. ATAC-seq farklı numune tipleri için modifiye edilmiş olmasına rağmen, yağ dokuları için ATAC-seq yöntemlerinin etkili modifikasyonları olmamıştır. Yağ dokuları ile ilgili zorluklar arasında karmaşık hücresel heterojenite, büyük lipit içeriği ve yüksek mitokondriyal kontaminasyon sayılabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, transgenik muhabir Nuclear etiketleme ve Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) faresinden yağ dokuları ile floresan aktive edilmiş çekirdek sıralama kullanarak adiposit spesifik ATAC-seq sağlayan bir protokol geliştirdik. Bu protokol, çekirdek girişi ve reaktiflerin miktarını azaltırken minimum boşa harcanan sıralama okumalarıyla yüksek kaliteli veriler üretir. Bu yazıda, fare yağ dokularından izole edilen adiposit çekirdeklerinin kullanımı için doğrulanmış ATAC-seq yöntemi için ayrıntılı adım adım talimatlar verilmektedir. Bu protokol, adipositlerdeki kromatin dinamiklerinin çeşitli biyolojik stimülasyonlar üzerinde araştırılmasına yardımcı olacak ve bu da yeni biyolojik anlayışlara izin verecektir.

Introduction

Fazla enerjiyi lipit molekülleri şeklinde depolamak için uzmanlaşmış olan yağ dokusu, metabolik düzenleme için kilit bir organdır. Adiposit oluşumunun ve bakımının sıkı kontrolü, yağ dokusu fonksiyonu ve tüm vücut enerji homeostazı için hayati öneme sahiptir1. Birçok transkripsiyonel düzenleyici, adiposit farklılaşmasının, plastisitesinin ve fonksiyonunun kontrolünde kritik bir rol oynamaktadır; Bu düzenleyicilerin bazıları insanlarda metabolik bozukluklarla ilişkilidir 2,3. Gen ekspresyonu ve epigenomik analiz için yüksek verimli dizileme tekniklerindeki son gelişmeler, adiposit biyolojisinin moleküler düzenleyicilerinin keşfini daha da kolaylaştırmıştır4. Yağ dokularını kullanan moleküler profilleme çalışmaları, bu dokuların heterojenliği nedeniyle zordur. Yağ dokusu öncelikle yağ depolamadan sorumlu olan adipositlerden oluşur, ancak aynı zamanda fibroblastlar, endotel hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi çeşitli diğer hücre tiplerini de içerir5. Ek olarak, yağ dokusunun hücresel bileşimi, sıcaklık ve beslenme durumu6 gibi patofizyolojik değişikliklere yanıt olarak dramatik bir şekilde değişir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, daha önce GFP etiketli ribozomlar ve mCherry etiketli biyotinile çekirdekleri Cre rekombinazına bağımlı bir şekilde üreten Nükleer Etiketleme ve Çevirme Ribozom Afinite Saflaştırma (NuTRAP) adlı transgenik bir muhabir fare geliştirdik7. Çift etiketleme sistemi, dokularla hücre tipine özgü transkriptomik ve epigenomik analizlerin yapılmasını sağlar. Adiposit-spesifik adiponektin-Cre hatları (Adipoq-NuTRAP) ile çaprazlanan NuTRAP farelerini kullanarak, daha önce in vivo saf adiposit popülasyonlarından gen ekspresyon profillerini ve kromatin durumlarını karakterize ettik ve obezite sırasında nasıl değiştiklerini belirledik 7,8. Daha önce, NuTRAP fareleri kahverengi ve bej adiposit spesifik Ucp1-Cre çizgileri (Ucp1-NuTRAP) ile geçti, sıcaklık değişimlerine yanıt olarak nadir termojenik adiposit popülasyonunun, bej adipositlerin epigenomik yeniden şekillenmesini karakterize etmemize izin verdi9.

ATAC-seq, genom çapında kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan analitik bir yöntemdir. ATAC-seq’te kullanılan hiper-reaktif Tn5 transpozaz, çekirdeklerin kromatinden erişilebilir bölgesindeki dizileme adaptörlerini etiketleyerek açık kromatin bölgelerinin tanımlanmasına izin verir10. ATAC-seq basit bir yöntemdir, ancak sağlam sonuçlar sağlar ve düşük girişli numunelerde bile oldukça verimlidir. Bu nedenle, en popüler epigenomik profilleme yöntemlerinden biri haline gelmiştir ve çeşitli biyolojik bağlamlarda gen ekspresyonunun düzenleyici mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Orijinal ATAC-seq protokolü oluşturulduğundan beri, protokolü çeşitli numune türleri için değiştirmek ve optimize etmek için çeşitli ATAC-seq türevi teknikler daha da geliştirilmiştir. Örneğin, Fast-ATAC kan hücresi örneklerini analiz etmek için tasarlanmıştır11, Omni-ATAC dondurulmuş doku örnekleri12 için optimize edilmiş bir protokoldür ve MiniATAC-seq erken evre embriyo analizi13 için etkilidir. Bununla birlikte, ATAC-seq yönteminin adipositlere, özellikle doku örneklerinden uygulanması hala zordur. Yağ dokusunun heterojenliğine ek olarak, yüksek lipid içeriği, çekirdek izolasyonundan sonra bile Tn5 transpozaz tarafından etkili rekombinasyon reaksiyonlarına müdahale edebilir. Ayrıca, adipositlerdeki, özellikle kahverengi ve bej adipositlerdeki yüksek mitokondriyal içerik, yüksek mitokondriyal DNA kontaminasyonuna ve boşa harcanan dizileme okumalarına neden olur. Bu yazıda Adipoq-NuTRAP fareleri kullanılarak adiposit-spesifik ATAC-seq için bir protokol açıklanmaktadır (Şekil 1). Floresan etiketli çekirdek sıralamadan yararlanarak, bu protokol adiposit çekirdeğinin saf popülasyonlarının diğer kafa karıştırıcı hücre tiplerinden uzakta toplanmasına ve lipitlerin, mitokondrilerin ve doku kalıntılarının etkili bir şekilde uzaklaştırılmasına izin verir. Bu nedenle, bu protokol hücre tipine özgü yüksek kaliteli veriler üretebilir ve standart protokole kıyasla daha az miktarda girdi ve reaktif kullanırken mitokondriyal okumalardan kaynaklanan israfı en aza indirebilir.

Protocol

Hayvan bakımı ve deneyleri, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan prosedürlere göre gerçekleştirildi. 1. Deneye başlamadan önceki hazırlıklar Doku hazırlamaAdiposit çekirdeği etiketlemesi için, hem Adipoq-Cre hem de NuTRAP için hemizygot olan Adipoq-NuTRAP fareleri üretmek için NuTRAP farelerini adiposit spesifik adiponektin-Cre hatları (Adipoq-Cre) ile çaprazlayın.</li…

Representative Results

Bu ATAC-seq protokolünü kullanarak yağ dokusunu analiz etmek için, chow diyetleriyle beslenen Adipoq-NuTRAP fareleri ürettik; daha sonra epididim beyaz yağ dokusundan (eWAT), inguinal beyaz yağ dokusundan (iWAT) ve kahverengi yağ dokusundan (BAT) akım sitometrisi kullanarak adiposit çekirdeklerini izole ettik. İzole edilen çekirdekler etiketleme için kullanıldı, bunu yukarıda açıklandığı gibi DNA saflaştırma, PCR amplifikasyonu, kalite kontrol adımları, dizileme ve veri analizi izledi. Bu temsili…

Discussion

Bu yazıda, adiposit spesifik kromatin erişilebilirliğini in vivo olarak değerlendirmek için optimize edilmiş bir ATAC-seq protokolü sunduk. Adipoq-NuTRAP fareyi kullanan bu ATAC-seq protokolü, adiposite özgü kromatin erişilebilirlik profillerini başarıyla oluşturdu. Başarılı ve tekrarlanabilir ATAC-seq deneyleri için en kritik faktör çekirdek kalitesidir. Disseke edilmiş yağ dokularının sıvı azot içinde derhal yapışıp dondurulması ve kullanıma kadar çözülmeden -80 ° C’de güve…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, IUSM Showalter Araştırma Güven Fonu (H.C.R.’ye), bir IUSM Diyabet ve Metabolik Hastalıklar Merkezi Pilot ve Fizibilite hibesi (HCR’ye), Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK129289’dan H.C.R.’ye) ve Amerikan Diyabet Derneği Genç Fakülte Ödülü (7-21-JDF-056’dan H.C.R.’ye) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Animals
Adiponectin-Cre mouse The Jackson Laboratory 28020
NuTRAP mouse The Jackson Laboratory 29899
Reagents & Materials
1.5 mL DNA-LoBind tubes Eppendorf 86-923
100 µm cell strainer Falcon 352-360
15 mL tubes VWR 525-1071
2x TD buffer Illumina 15027866
384-well PCR plate Applied biosystem 4483285
40 µm cell strainer Falcon 352-340
50 mL tubes VWR 525-1077
AMPure XP reagent (SPRI beads) Beckman Coulter A63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit Agilent Technologies 5067-4626
Clear adhesive film Applied biosystem 4306311
DNase/RNase-free distilled water Invitrogen 10977015
Dounce tissue grinder DWK Life Sciences 357542
DTT Sigma D9779
DynaMag-96 side skirted magnet Thermo Fishers 12027
FACS tubes Falcon  28719128
HEPES Boston BioProducts BBH-75
Hoechst 33342 Invitrogen 2134015
KCl (2 M) Boston BioProducts MT-252
Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips EpiCypher 10-0008
MgCl2 (1 M) Boston BioProducts MT-200
MinElute PCR purification kit Qiagen 28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix BioLabs M0541S
NP40 Thermo Fishers 28324
PCR 8-tube strip USA scientific 1402-4708
Protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fishers 78439
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851
Sucrose Sigma S0389-1KG
SYBR Green I (10,000x) Invitrogen S7563
TDE I enzyme Illumina 15027865
Instruments
Flow cytometer BD Biosciences FACSAria Fusion
Qubit fluorometer Invitrogen Q33226
Real-Time PCR system Thermo Fishers QuantStudio 5

References

  1. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  2. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  3. Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
  4. Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
  5. Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
  6. Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
  7. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  8. Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
  9. Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
  10. Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  11. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  12. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  13. Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
  14. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
  15. So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
  16. Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
  17. Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin’s hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).

Play Video

Cite This Article
Kim, K., Taleb, S., So, J., Wann, J., Cheol Roh, H. Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting. J. Vis. Exp. (193), e65033, doi:10.3791/65033 (2023).

View Video