ATAC-Seq específico de adipocitos con tejidos adiposos mediante clasificación de núcleos activados por fluorescencia

El tejido adiposo, que está especializado para almacenar el exceso de energía en forma de moléculas lipídicas, es un órgano clave para la regulación metabólica. El control estricto de la formación y mantenimiento de los adipocitos es vital para la función del tejido adiposo y la homeostasis energética de todo el cuerpo¹. Muchos reguladores transcripcionales desempeñan un papel crítico en el control de la diferenciación, plasticidad y función de los adipocitos; Algunos de estos reguladores están implicados en trastornos metabólicos en humanos ^2,3. Los avances recientes en técnicas de secuenciación de alto rendimiento para la expresión génica y el análisis epigenómico han facilitado aún más el descubrimiento de los reguladores moleculares de la biología de los adipocitos⁴. Los estudios de perfiles moleculares que utilizan tejidos adiposos son difíciles de realizar debido a la heterogeneidad de estos tejidos. El tejido adiposo consiste principalmente en adipocitos, que son responsables del almacenamiento de grasa, pero también contiene varios otros tipos de células, como fibroblastos, células endoteliales y células inmunes⁵. Además, la composición celular del tejido adiposo se altera dramáticamente en respuesta a cambios fisiopatológicos como la temperatura y el estado nutricional⁶. Para superar estos problemas, previamente desarrollamos un ratón reportero transgénico, llamado Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), que produce ribosomas marcados con GFP y núcleos biotinilados marcados con mCherry de una manera dependiente de la recombinasa Cre⁷. El sistema de doble etiquetado permite realizar análisis transcriptómicos y epigenómicos específicos del tipo de célula con tejidos. Utilizando ratones NuTRAP cruzados con líneas adiponectina-Cre específicas de adipocitos (Adipoq-NuTRAP), previamente caracterizamos perfiles de expresión génica y estados de cromatina de poblaciones de adipocitos puros in vivo y determinamos cómo se alteran durante la obesidad ^7,8. Anteriormente, los ratones NuTRAP cruzados con líneas Ucp1-Cre específicas de adipocitos marrones y beige (Ucp1-NuTRAP) nos permitieron caracterizar la remodelación epigenómica de la rara población de adipocitos termogénicos, los adipocitos beige, en respuesta a los cambios de temperatura⁹.

ATAC-seq es un método analítico ampliamente utilizado para evaluar la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma. La transposasa Tn5 hiperreactiva utilizada en ATAC-seq permite la identificación de regiones de cromatina abiertas mediante el etiquetado de adaptadores de secuenciación en la región accesible a la cromatina de los núcleos¹⁰. ATAC-seq es un método simple, pero proporciona resultados robustos y es altamente eficiente incluso con muestras de baja entrada. Por lo tanto, se ha convertido en uno de los métodos de perfil epigenómico más populares y ha contribuido a la comprensión de los mecanismos reguladores de la expresión génica en diversos contextos biológicos. Desde que se creó el protocolo ATAC-seq original, se han desarrollado varias técnicas derivadas de ATAC-seq para modificar y optimizar el protocolo para varios tipos de muestras. Por ejemplo, Fast-ATAC está diseñado para analizar muestras de células sanguíneas¹¹, Omni-ATAC es un protocolo optimizado para muestras de tejido congelado 12 y MiniATAC-seq es eficaz para el análisis de embriones en etapa temprana¹³. Sin embargo, la aplicación del método ATAC-seq a los adipocitos, especialmente de muestras de tejido, sigue siendo un desafío. Además de la heterogeneidad del tejido adiposo, su alto contenido de lípidos puede interferir con reacciones de recombinación eficientes por la transposasa Tn5 incluso después del aislamiento del núcleo. Además, el alto contenido mitocondrial en los adipocitos, particularmente en los adipocitos marrones y beige, causa una alta contaminación del ADN mitocondrial y lecturas de secuenciación desperdiciadas. Este artículo describe un protocolo para ATAC-seq específico de adipocitos utilizando ratones Adipoq-NuTRAP (Figura 1). Al aprovechar la clasificación de núcleos marcados con fluorescencia, este protocolo permite la recolección de poblaciones puras de núcleos de adipocitos lejos de otros tipos de células de confusión y la eliminación eficiente de lípidos, mitocondrias y restos de tejidos. Por lo tanto, este protocolo puede generar datos de alta calidad específicos del tipo de célula y minimizar el desperdicio de las lecturas mitocondriales mientras se utiliza una cantidad reducida de entrada y reactivos en comparación con el protocolo estándar.