蛍光活性化核ソーティングを用いた脂肪組織を用いた脂肪細胞特異的ATAC-Seq

脂質分子の形で余分なエネルギーを蓄えることに特化した脂肪組織は、代謝調節の重要な器官です。脂肪細胞の形成と維持の厳密な制御は、脂肪組織の機能と全身のエネルギー恒常性に不可欠です¹。多くの転写調節因子は、脂肪細胞の分化、可塑性、および機能の制御において重要な役割を果たします。これらの調節因子のいくつかは、ヒトの代謝障害に関与しています^2,3。遺伝子発現およびエピゲノム解析のためのハイスループットシーケンシング技術の最近の進歩により、脂肪細胞生物学の分子調節因子の発見がさらに促進されました⁴。脂肪組織を用いた分子プロファイリング研究は、これらの組織の不均一性のために実施が困難です。脂肪組織は主に脂肪貯蔵を担う脂肪細胞で構成されていますが、線維芽細胞、内皮細胞、免疫細胞など、他のさまざまな細胞タイプも含まれています⁵。さらに、脂肪組織の細胞組成は、温度や栄養状態などの病態生理学的変化に応じて劇的に変化します⁶。これらの問題を克服するために、私たちは以前に、GFPタグ付きリボソームとmCherryタグ付きビオチン化核をCreリコンビナーゼ依存的に生成するトランスジェニックレポーターマウス「核タグ付けおよび翻訳リボソームアフィニティー精製(NuTRAP)」を開発しました⁷。二重標識システムにより、組織を用いて細胞種特異的なトランスクリプトーム解析およびエピゲノム解析を行うことができます。脂肪細胞特異的アディポネクチン-Cre株(Adipoq-NuTRAP)と交配したNuTRAPマウスを使用して、in vivoで純粋な脂肪細胞集団からの遺伝子発現プロファイルとクロマチン状態を以前に特徴付け、肥満時にそれらがどのように変化するかを決定しました^7,8。以前、茶色とベージュ色の脂肪細胞特異的Ucp1-Cre株(Ucp1-NuTRAP)と交配したNuTRAPマウスにより、温度変化に応答したまれな熱発生脂肪細胞集団であるベージュ脂肪細胞のエピゲノムリモデリングを特徴付けることができました⁹。

ATAC-seqは、ゲノム全体のクロマチンアクセシビリティを評価するために広く使用されている分析方法です。ATAC-seqで使用される超反応性Tn5トランスポザーゼは、核¹⁰のクロマチンアクセス可能な領域のシーケンシングアダプターにタグを付けることにより、開いたクロマチン領域の同定を可能にします。ATAC-seqはシンプルなメソッドですが、ロバストな結果が得られ、低インプットのサンプルでも非常に効率的です。したがって、それは最も人気のあるエピゲノムプロファイリング方法の1つになり、多様な生物学的文脈における遺伝子発現の制御メカニズムの理解に貢献してきました。オリジナルのATAC-seqプロトコルが作成されて以来、様々なタイプのサンプルに対してプロトコルを修正および最適化するために、様々なATAC-seq派生技術がさらに開発されてきた。例えば、Fast−ATACは血球サンプル¹¹の分析用に設計されており、Omni−ATACは凍結組織サンプル12用に最適化されたプロトコルであり、MiniATAC−seqは初期段階の胚分析¹³に有効である。しかし、ATAC-seq法を脂肪細胞、特に組織サンプルに適用することは依然として困難です。脂肪組織の不均一性に加えて、その高い脂質含有量は、核単離後もTn5トランスポザーゼによる効率的な組換え反応を妨げる可能性があります。さらに、脂肪細胞、特に茶色とベージュ色の脂肪細胞における高いミトコンドリア含有量は、高いミトコンドリアDNA汚染と無駄なシーケンシングリードを引き起こします。この論文では、Adipoq-NuTRAPマウスを用いた脂肪細胞特異的ATAC-seqのプロトコルについて説明します(図1)。蛍光標識された核ソーティングを利用することにより、このプロトコルは、他の交絡細胞タイプから離れた脂肪細胞核の純粋な集団の収集と、脂質、ミトコンドリア、および組織破片の効率的な除去を可能にします。したがって、このプロトコルは、標準プロトコルと比較して少ない入力量と試薬を使用しながら、細胞タイプ固有の高品質データを生成し、ミトコンドリアリードからの無駄を最小限に抑えることができます。