Ottimizzazione del processo di preparazione dei campioni per la microscopia elettronica a trasmissione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila
Summary
Questo rapporto fornisce una nuova procedura di preparazione del campione per la visualizzazione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila . Questo metodo è più efficace nel prevenire l’arricciamento dei campioni rispetto al metodo tradizionale ed è particolarmente utile per l’analisi ultrastrutturale della giunzione neuromuscolare della Drosophila .
Abstract
La giunzione neuromuscolare della Drosophila (NMJ) è emersa come un prezioso sistema modello nel campo delle neuroscienze. L’applicazione della microscopia confocale presso l’NMJ di Drosophila consente ai ricercatori di acquisire informazioni sinaptiche, comprendendo sia dati quantitativi sull’abbondanza delle sinapsi che approfondimenti dettagliati sulla loro morfologia. Tuttavia, la distribuzione diffusa e il raggio visivo limitato del TEM presentano sfide per l’analisi ultrastrutturale. Questo studio introduce un metodo di preparazione dei campioni innovativo ed efficiente che supera l’approccio convenzionale. La procedura inizia posizionando una rete metallica alla base di una bottiglia a fondo piatto o di una provetta, seguita dal posizionamento di campioni di larve fisse sulla rete. Una rete aggiuntiva viene posizionata sopra i campioni, assicurandosi che siano posizionati tra le due maglie. I campioni fissati vengono accuratamente disidratati e infiltrati prima di procedere con la procedura di inclusione. Quindi l’inclusione dei campioni in resina epossidica viene eseguita in modo piatto, il che consente la preparazione dei muscoli per il posizionamento e il sezionamento. Beneficiando di questi passaggi, tutti i muscoli delle larve di Drosophila possono essere visualizzati al microscopio ottico, facilitando così il successivo posizionamento e sezionamento. La resina in eccesso viene rimossa dopo aver localizzato il 6° e il 7° muscolo dei segmenti del corpo A2 e A3. Viene eseguita una sezionamento seriale ultrasottile del 6° o 7° muscolo.
Introduction
La microscopia elettronica è uno dei metodi più ideali per studiare l’ultrastruttura dei materiali biologici in grado di dimostrare visivamente e accuratamente la struttura interna delle celluleal livello 1 della nanoscala. Tuttavia, a causa della complessità del processo di preparazione del campione e del costo elevato, la microscopia elettronica non è così popolare come la microscopia ottica. I recenti progressi nelle tecniche di microscopia elettronica hanno portato a miglioramenti significativi nella qualità dell’immagine, in coincidenza con una notevole riduzione del carico di lavoro associato. Di conseguenza, la microscopia elettronica ha assunto un ruolo importante nel progresso delle conoscenze scientifiche in diversi campi2.
La Drosophila è un eccellente modello animale per eseguire manipolazioni genetiche per controllare con precisione l’espressione spaziale e temporale dei geni bersaglio3. Inoltre, la Drosophila ha i vantaggi di un breve periodo di crescita e di un facile allevamento rispetto ai modelli di mammiferi; pertanto, la Drosophila è ampiamente utilizzata nella ricerca morfologica 4,5.
Nelle larve di Drosophila, i bottoni della giunzione neuromuscolare (NMJ) sono ampiamente distribuiti nei muscoli 6,7 e l’immunocolorazione della NMJ può facilmente fornire informazioni sulla quantità e la morfologia delle sinapsi 8,9 . I bottoni NMJ situati nel 6°/7° muscolo dei segmenti A2 e A3 sono adatti per la ricerca quantitativa e morfologica utilizzando la microscopia ottica. Ciò è dovuto alle loro dimensioni e abbondanza10,11. Pertanto, le NMJ delle larve di Drosophila sono considerate un modello utile per la ricerca neuroscientifica12.
Tuttavia, è difficile osservare l’ultrastruttura a bottone NMJ da parte del TEM. Poiché la finestra di scansione della microscopia elettronica a trasmissione è ristretta, è difficile posizionare i bottoni NMJ13, ampiamente distribuiti. L’altro motivo è che la parete corporea della Drosophila è suscettibile all’arricciamento durante la fase di disidratazione alcolica del protocollo di preparazione del campione7.
Gli studi tradizionali hanno solitamente scelto i bottoni tra il 6° e il 7° muscolo dei segmenti A2 e A3 come materiali campione a causa della loro abbondanza e delle dimensioni14,15. I muscoli 6° e 7° dei segmenti A2 e A3 sono più grandi degli altri muscoli e contengono più bottoni. Tuttavia, quando i campioni venivano preparati per la microscopia elettronica, i campioni fissati tendevano a diventare sottili e inclini ad arricciarsi, portando così a un posizionamento improprio del 6° e 7° muscolo dei segmenti A2 e A3.
Riportiamo con la presente una nuova procedura di processamento che risulta più efficace nel prevenire l’arricciamento dei campioni rispetto al metodo tradizionale di preparazione dei campioni 7,16, consentendo ai campioni di rimanere piatti durante la successiva disidratazione, facilitando così un migliore posizionamento delle giunzioni neuromuscolari larvali di Drosophila.
Protocol
Representative Results
Discussion
I campioni di larve di Drosophila tendono ad arricciarsi durante la disidratazione, poiché i campioni sono sottili, rendendo difficile localizzare con precisione la giunzione neuromuscolare, aumentando così la difficoltà e il carico di lavoro per la preparazione del campione. Il miglioramento tradizionale consiste nell’accorciare il campione7, ma i campioni erano ancora arricciati in misura diversa.
Nel nostro metodo, ci sono due passaggi critici: in primo l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Natural Science Foundation of China Grant 32070811 e dal Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. Ringraziamo il Laboratorio di Microscopia Elettronica e il Centro di Analisi Morfologica, Scuola di Medicina, Università del Sud-Est, Nanchino, Cina.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
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