Optimisation du processus de préparation d’échantillons pour la microscopie électronique à transmission des jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile
Summary
Ce rapport fournit une nouvelle procédure de préparation d’échantillons pour visualiser les jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile . Cette méthode est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle et est particulièrement utile pour l’analyse ultrastructurale de la jonction neuromusculaire de la drosophile .
Abstract
La jonction neuromusculaire (JNM) de la drosophile est devenue un système modèle précieux dans le domaine des neurosciences. L’application de la microscopie confocale chez la drosophile NMJ permet aux chercheurs d’acquérir des informations synaptiques, englobant à la fois des données quantitatives sur l’abondance des synapses et des informations détaillées sur leur morphologie. Cependant, la distribution diffuse et la portée visuelle limitée du TEM présentent des défis pour l’analyse ultrastructurale. Cette étude présente une méthode innovante et efficace de préparation des échantillons qui surpasse l’approche conventionnelle. La procédure commence par la mise en place d’un treillis métallique à la base d’une bouteille ou d’un tube à essai à fond plat, puis par le positionnement d’échantillons de larves fixes sur le treillis. Un maillage supplémentaire est placé sur les échantillons, en veillant à ce qu’ils soient positionnés entre les deux mailles. Les échantillons fixés sont soigneusement déshydratés et infiltrés avant de procéder à la procédure d’enrobage. Ensuite, l’enrobage des échantillons dans de la résine époxy est effectué à plat, ce qui permet de préparer les muscles pour le positionnement et la section. Grâce à ces étapes, tous les muscles des larves de drosophile peuvent être visualisés en microscopie optique, ce qui facilite le positionnement et la sectionnement ultérieurs. L’excès de résine est éliminé après avoir localisé les 6e et 7e muscles des segments corporels A, 2 et A, 3. Une section ultra-mince en série du 6ème ou 7ème muscle est effectuée.
Introduction
La microscopie électronique est l’une des méthodes les plus idéales pour étudier l’ultrastructure des matériaux biologiques qui permet de démontrer visuellement et avec précision la structure interne des cellules au niveau1 à l’échelle nanométrique. Cependant, en raison de la complexité du processus de préparation des échantillons et du coût élevé, la microscopie électronique n’est pas aussi populaire que la microscopie optique. Les progrès récents des techniques de microscopie électronique ont permis d’améliorer considérablement la qualité des images, ce qui a coïncidé avec une réduction remarquable de la charge de travail associée. Par conséquent, la microscopie électronique a joué un rôle important dans l’avancement des connaissances scientifiques dans divers domaines2.
La drosophile est un excellent modèle animal pour effectuer des manipulations génétiques afin de contrôler précisément l’expression spatiale et temporelle des gènes cibles3. De plus, la drosophile présente les avantages d’une courte période de croissance et d’un élevage facile par rapport aux modèles mammifères ; par conséquent, la drosophile est largement utilisée dans la recherche morphologique 4,5.
Chez les larves de drosophile, les boutons de jonction neuromusculaire (JNM) sont largement répartis dans les muscles 6,7, et l’immunocoloration de la JNM peut facilement fournir des informations sur la quantité et la morphologie des synapses 8,9 . Les boutons NMJ situés dans les muscles 6e/7des segments A2 et A3 sont bien adaptés à la recherche quantitative et morphologique par microscopie optique. C’est à cause de leur taille et de leur abondance10,11. Par conséquent, les larves de drosophile sont considérées comme un modèle utile pour la recherche en neurosciences12.
Cependant, il est difficile d’observer l’ultrastructure du bouton NMJ par le TEM. Étant donné que la fenêtre de balayage de la microscopie électronique à transmission est étroite, il est difficile de positionner les boutons NMJ13 largement distribués. L’autre raison est que la paroi corporelle de la drosophile est susceptible de s’enrouler pendant l’étape de déshydratation alcoolique du protocole de préparation des échantillons7.
Les études traditionnelles ont généralement choisi des boutons entre les 6ème et 7ème muscles dessegments A2 et A3 comme matériaux d’échantillonnage en raison de leur abondance et de leur taille14,15. Les 6eet 7emuscles des segments A2 et A3 sont plus gros que les autres muscles et contiennent plus de boutons. Cependant, lorsque des échantillons ont été préparés pour la microscopie électronique, les échantillons fixes avaient tendance à devenir minces et sujets à l’enroulement, ce qui entraînait un mauvais positionnement des 6e et 7e muscles des segments A2 et A3.
Nous rapportons ici une nouvelle procédure de traitement qui est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle de préparation des échantillons 7,16, en permettant aux échantillons de rester plats pendant la déshydratation ultérieure, facilitant ainsi un meilleur positionnement des jonctions neuromusculaires larvaires de la drosophile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les échantillons de larves de drosophile ont tendance à se recroqueviller pendant la déshydratation, car les échantillons sont minces, ce qui rend difficile la localisation précise de la jonction neuromusculaire, augmentant ainsi la difficulté et la charge de travail pour la préparation des échantillons. L’amélioration traditionnelle consiste à raccourcir l’échantillon7, mais les échantillons étaient toujours enroulés à des degrés différents.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation des sciences naturelles de Chine 32070811 et le Fonds d’essai d’analyse de l’Université du Sud-Est (Chine) 11240090971. Nous remercions le Laboratoire de microscopie électronique et le Centre d’analyse morphologique, École de médecine, Université du Sud-Est, Nanjing, Chine.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
References
- Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
- Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).
- Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
- Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).
- Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
- Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
- Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
- Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).
- Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
- Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
- Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
- Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
- Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
- Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).
