דוח זה מספק הליך הכנת מדגם חדש להדמיית צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה . שיטה זו יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית והיא שימושית במיוחד עבור Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.
הצומת הנוירומוסקולרית דרוזופילה (NMJ) התפתחה כמערכת מודל רבת ערך בתחום מדעי המוח. היישום של מיקרוסקופ קונפוקלי ב – Drosophila NMJ מאפשר לחוקרים להשיג מידע סינפטי, המקיף הן נתונים כמותיים על שפע סינפסות והן תובנות מפורטות לגבי המורפולוגיה שלהם. עם זאת, ההתפלגות המפוזרת והטווח החזותי המוגבל של ה- TEM מציבים אתגרים לניתוח האולטרה-סטרוקטורלי. מחקר זה מציג שיטת הכנת דגימות חדשנית ויעילה העולה על הגישה הקונבנציונלית. ההליך מתחיל בהנחת רשת מתכת בבסיס בקבוק או מבחנה בעלת תחתית שטוחה, ולאחר מכן מיקום דגימות זחלים קבועות על הרשת. רשת שינוי נוספת מונחת מעל הדגימות, כדי להבטיח שהן ממוקמות בין שתי רשתות השינוי. הדגימות הקבועות מיובשות היטב ומוחדרות לפני שממשיכים בהליך ההטבעה. לאחר מכן הטבעה של הדגימות בשרף אפוקסי מתבצעת באופן יריעה שטוחה, המאפשרת הכנת שרירים למיקום וחתך. כתוצאה מצעדים אלה, ניתן לדמיין את כל השרירים של זחלי דרוזופילה תחת מיקרוסקופ אור, ובכך להקל על המיקום והחתך הבאים. עודף שרף מוסר לאחר איתור השרירים ה– 6 וה– 7 של חלקי הגוף A2 ו- A3. מבוצעת חתך טורי דק במיוחד של השריר ה– 6 או ה– 7.
מיקרוסקופ אלקטרונים הוא אחת השיטות האידיאליות ביותר לחקר מבנה העל של חומרים ביולוגיים שיכולים להדגים חזותית ומדויקת את המבנה הפנימי של תאים ברמה ננומטרית1. עם זאת, בשל מורכבות תהליך הכנת הדגימה והעלות הגבוהה, מיקרוסקופ אלקטרונים אינו פופולרי כמו מיקרוסקופ אור. ההתקדמות האחרונה בטכניקות מיקרוסקופיית אלקטרונים הובילה לשיפור משמעותי באיכות התמונה, במקביל להפחתה יוצאת דופן בעומס העבודה הנלווה. כתוצאה מכך, מיקרוסקופ אלקטרונים תפס תפקיד חשוב בקידום הידע המדעי בתחומים מגוונים2.
דרוזופילה הוא מודל חייתי מצוין לביצוע מניפולציות גנטיות כדי לשלוט במדויק בביטוי המרחבי והזמני של גני מטרה3. חוץ מזה, לדרוזופילה יש את היתרונות של תקופת גדילה קצרה וגידול קל בהשוואה למודלים של יונקים; לכן, דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב במחקר מורפולוגיה 4,5.
בזחלי דרוזופילה, בוטוני צומת נוירומוסקולרי (NMJ) מופצים באופן נרחב בשרירים 6,7, ו immunostaining של NMJ יכול בקלות לספק מידע על כמות סינפסה ומורפולוגיה 8,9 . בוטי NMJ הממוקמיםבשרירים 6/7 של מקטעי A2 ו- A3 מתאימים היטב למחקר כמותי ומורפולוגי באמצעות מיקרוסקופ אור. הסיבה לכך היא גודלם ושפע10,11. לכן, זחלי דרוזופילה NMJ נחשבים מודל שימושי למחקר מדעי המוח12.
עם זאת, זה מאתגר לצפות NMJ bouton ultrastructure על ידי TEM. מכיוון שחלון הסריקה של מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת צר, קשה למקם את הבוטונים NMJ המפוזרים באופן נרחב13. הסיבה השנייה היא שדופן הגוף של דרוזופילה רגישה לסלסול במהלך שלב התייבשות האלכוהול של פרוטוקול הכנת הדגימה7.
מחקרים מסורתיים בדרך כלל בחרו בשרירים בין השרירים ה–6 וה–7 של קטעי A2 ו- A3 כחומרים לדוגמה בגלל השפע והגודל שלהם14,15. השריריםה-6 וה-7 במקטעי A2 ו-A 3 גדולים יותר מהשרירים האחרים ומכילים יותר בוטונים. עם זאת, כאשר הדגימות הוכנו למיקרוסקופ אלקטרונים, דגימות קבועות נטו להיות דקות ונוטות לסלסל, מה שהוביל למיקום לא נכון של השריריםה –6 וה–7 של קטעי A2 ו- A3.
אנו מדווחים בזאת על הליך עיבוד חדש היעיל יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית של הכנת הדגימות 7,16, בכך שהוא מאפשר לדגימות להישאר שטוחות במהלך ההתייבשות שלאחר מכן, ובכך להקל על מיקום טוב יותר של הצמתים העצביים-שריריים של זחל דרוזופילה.
דגימות זחלי דרוזופילה נוטות להתכרבל במהלך התייבשות, מכיוון שהדגימות דקות, מה שמקשה על איתור מדויק של הצומת העצבית-שרירית, ובכך מגדיל את הקושי ועומס העבודה להכנת הדגימה. השיפור המסורתי הוא קיצור מדגם7, אך הדגימות עדיין היו מסולסלות בדרגות שונות.
בשיטה שלנו ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין מענק 32070811, ו אוניברסיטת דרום מזרח (סין) ניתוח מבחן קרן 11240090971. אנו מודים למעבדה למיקרוסקופיית אלקטרונים ולמרכז לניתוח מורפולוגי, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת דרום-מזרח, נאנג’ינג, סין.
1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |