يقدم هذا التقرير إجراء جديدا لإعداد العينات لتصور الوصلات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة . هذه الطريقة أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية وهي مفيدة بشكل خاص لتحليل البنية التحتية للوصلات العصبية العضلية ذبابة الفاكهة .
برز تقاطع ذبابة الفاكهة العصبي العضلي (NMJ) كنظام نموذجي قيم في مجال علم الأعصاب. يتيح تطبيق الفحص المجهري متحد البؤر في ذبابة الفاكهة NMJ للباحثين الحصول على معلومات متشابكة ، تشمل كلا من البيانات الكمية حول وفرة المشابك العصبية والرؤى التفصيلية في مورفولوجيتها. ومع ذلك ، فإن التوزيع المنتشر والنطاق البصري المحدود ل TEM يمثلان تحديات للتحليل البنيوي الفائق. تقدم هذه الدراسة طريقة مبتكرة وفعالة لإعداد العينات تتجاوز النهج التقليدي. يبدأ الإجراء بوضع شبكة معدنية في قاعدة زجاجة مسطحة القاع أو أنبوب اختبار ، يليه وضع عينات اليرقات الثابتة على الشبكة. يتم وضع شبكة إضافية فوق العينات ، مما يضمن وضعها بين الشبكتين. يتم تجفيف العينات الثابتة تماما واختراقها قبل الشروع في إجراء التضمين. ثم يتم تضمين العينات في راتنجات الايبوكسي بطريقة ورقة مسطحة ، مما يسمح بإعداد العضلات لتحديد المواقع والتقسيم. بالاستفادة من هذه الخطوات ، يمكن تصور جميع عضلات يرقات ذبابة الفاكهة تحت المجهر الضوئي ، مما يسهل تحديد المواقع والتقسيم لاحقا. تتم إزالة الراتنج الزائد بعدتحديد موقع العضلات 6 و 7 من أجزاء الجسم A2 و A3. يتم إجراء التقسيم التسلسلي الرقيق للغايةللعضلة 6 أو 7.
يعد المجهر الإلكتروني أحد أكثر الطرق مثالية لدراسة البنية التحتية للمواد البيولوجية التي يمكنها إظهار البنية الداخلية للخلايا بصريا وبدقة على المستوىالنانوي 1. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد عملية تحضير العينة والتكلفة العالية ، فإن المجهر الإلكتروني ليس شائعا مثل الفحص المجهري الضوئي. أدت التطورات الحديثة في تقنيات المجهر الإلكتروني إلى تحسينات كبيرة في جودة الصورة ، بالتزامن مع انخفاض ملحوظ في عبء العمل المرتبط بها. وبالتالي ، فقد لعب المجهر الإلكتروني دورا مهما في تطوير المعرفة العلمية في مجالات متنوعة2.
ذبابة الفاكهة هي نموذج حيواني ممتاز لأداء التلاعب الجيني للتحكم بدقة في التعبير المكاني والزماني للجينات المستهدفة3. إلى جانب ذلك ، تتمتع ذبابة الفاكهة بمزايا فترة نمو قصيرة وتربية سهلة مقارنة بنماذج الثدييات. لذلك ، يستخدم ذبابة الفاكهة على نطاق واسع في أبحاث التشكل4،5.
في يرقات ذبابة الفاكهة ، يتم توزيع عراوات الوصلة العصبية العضلية (NMJ) على نطاق واسع في العضلات 6,7 ، ويمكن أن يوفر التلوين المناعي ل NMJ بسهولة معلومات عن كمية المشبك العصبي والتشكل 8,9. إن عروات NMJ الموجودةفي العضلات 6 / 7 من المقاطعA 2 وA 3 مناسبة تماما للبحث الكمي والمورفولوجي باستخدام المجهر الضوئي. هذا بسبب حجمها ووفرتها10,11. لذلك ، تعتبر يرقات ذبابة الفاكهة NMJs نموذجا مفيدا لأبحاث علم الأعصاب12.
ومع ذلك ، من الصعب مراقبة البنية التحتية ل NMJ bouton بواسطة TEM. نظرا لأن نافذة المسح للمجهر الإلكتروني النافذ ضيقة ، فمن الصعب وضع عروات NMJ الموزعة على نطاق واسع13. السبب الآخر هو أن جدار جسم ذبابة الفاكهة عرضة للتجعيد أثناء خطوة تجفيف الكحول في بروتوكول تحضيرالعينة 7.
عادة ما تختار الدراسات التقليدية عرواتبين العضلات 6 و 7 من الجزأينA 2 وA 3 كمواد عينة بسبب وفرتها وحجمها14,15. العضلات 6 و 7 من الأجزاءA 2 و A3 أكبر من العضلات الأخرى وتحتوي على المزيد من العروات. ومع ذلك ، عندما تم تحضير العينات للمجهر الإلكتروني ، تميل العينات الثابتة إلى أن تصبح رقيقة وعرضة للتجعيد ، مما يؤدي إلى وضع غير صحيحللعضلات 6 و 7 من الجزأين A2 وA 3.
نبلغ بموجب هذا عن إجراء معالجة جديد أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية لإعدادالعينات 7,16 ، من خلال السماح للعينات بالبقاء مسطحة أثناء الجفاف اللاحق ، وبالتالي تسهيل وضع أفضل للتقاطعات العصبية العضلية ليرقات ذبابة الفاكهة.
تميل عينات يرقات ذبابة الفاكهة إلى الالتفاف أثناء الجفاف ، حيث تكون العينات رقيقة ، مما يجعل من الصعب تحديد موقع الوصلة العصبية العضلية بدقة ، مما يزيد من صعوبة وعبء العمل لإعداد العينة. التحسين التقليدي هو تقصير العينة7 ، لكن العينات كانت لا تزال مجعدة بدرجات مختلفة.
<p…The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين جرانت 32070811 ، وصندوق اختبار التحليل بجامعة جنوب شرق (الصين) 11240090971. نشكر مختبر المجهر الإلكتروني ومركز التحليل المورفولوجي ، كلية الطب ، جامعة الجنوب الشرقي ، نانجينغ ، الصين.
1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |