初代アカゲザルB細胞の遺伝子編集

すべての動物の手順と実験は、国立衛生研究所の国立アレルギー感染症研究所の施設内動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。以下のプロトコルの概要を 図 1 に示します。2〜8歳のインドの遺伝的起源のオスとメスのアカゲザル(Macaca mulatta)は、実験動物の世話と使用に関する委員会のガイドラインに従って、バイオセーフティレベル2の施設で飼育され、世話をされました。 注意:すべての実験は、血液媒介 病原体に対する普遍的な予防措置に準拠して、無菌/無菌技術と層流フード内の適切なバイオセーフティレベル2機器を使用して実施されました。 1. rAAV6の生産 rAAV6産生用の試薬を準備します。標準的な手法を使用して、ベクターpAAV内のAAV2の逆末端リピート(ITR)の間に相同性指向修復テンプレートを設計し、クローニングします。ホモロジーアームが両側で少なくとも~250 bpであることを確認してくださいが、構成設計で許可されている場合は、より長いホモロジーアームが望ましいですが、わずか60 bpで十分です。使用されるsgRNAのいずれかの標的配列がHDRTに存在する場合は、標的部位のプロトスペーサー隣接モチーフまたはシード領域で最も効果的なサイレント変異を使用してそれらを除去します。注:効率的なクローニング32のためのギブソンアセンブリと組み合わせた遺伝子合成を実行できます。トランスフェクション用の正しいクローンのMaxiprepを準備します。sgRNAの設計にはCHOPCHOP33が推奨されており、その他のツールのリストは https://zlab.bio/guide-design-resources にあります。ITR を含む AAV の最大パッケージ容量は ~4.7 kb です。AAV6は、造血細胞、特にB細胞9の編集に最も一般的に使用される血清型です。アカゲザルB細胞の遺伝子編集のためのAAVの他の血清型は試験されていないが、AAV28およびAAV-DJ10,11がマウス研究で使用されている。 表1および表2に従って293AAV培地および生産培地を調製する。0.2 μmのポリエーテルスルホン(PES)メンブレンフィルターユニットを通した滅菌フィルター。4°Cで保存してください。 1xポリエチレンイミン(PEI)溶液(1 mg / mL、100 mL)を調製します。 250 mLのガラスビーカーで、電子レンジで~70 mLのH2Oを~30秒間加熱し、次に100 mgのPEIを加えます。マグネチックスターラーを追加し、PEIがほとんど溶解するまで攪拌します。 1 M HClでpHを7に調整し、次にH2Oで100 mLまで補充し、10分待ってからpHを再度確認し、必要に応じて調整します。 PEI溶液を0.2 μmのPESメンブレンフィルターユニットで滅菌ろ過し、アリコートして-20°Cで保存します。 解凍後、溶液は4°Cで最大2ヶ月間保存できます。 5xポリエチレングリコール(PEG)/NaCl溶液を調製します。 400 gのPEG 8,000と24 gのNaClを計量します。 2Lガラスビーカーにマグネチックスターラーを加え、計量したPEG8,000とNaClを加え、~550mLの脱イオン水ですすいでください。 加熱しながらかき混ぜ、完全に溶解するまで沸騰させるか、80〜90°Cにします。 1 M NaOHでpHを~7.4に調整し、メスシリンダーを使用して容量を1 Lに調整し、マグネチックスターラーで2 Lガラス瓶に移します。 このボトルをオートクレーブし、マグネチックスターラー、および溶液を水浴中で121°Cで30分間行った。 オートクレーブ後、異なる相への分離を防ぐために、マグネチックスターラーを使用して攪拌しながら、低温室で溶液を冷却します。必要に応じて分注し、4°Cで保存する。 製剤バッファーを調製する。 500 mLのDPBSを50 μLの10%プルロニックF-68と混合します。滅菌フィルターを0.2 μm PESメンブレンフィルターユニットに通し、室温(RT)で保存します。 rAAV6生産のための細胞培養、トランスフェクション、形質導入解凍、培養、および分割のための上記の293AAV培養培地およびトリプシン−EDTAを用いて製造業者によって記載された293AAV細胞を凍結する。いくつかの初期の継代を凍結し、継代40に達する前に細胞をAAV産生に使用することをお勧めします。 rAAV6生産のために、4つの15cm細胞培養皿にそれぞれ30mLの5 x 106 細胞を播種します。細胞は、通常、播種後1〜2日で80%〜90%のコンフルエントに達すると、トランスフェクションの準備が整います。 AAV6にパッケージ化されるHDRTを含むpAAVプラスミドのマキシプレップを解凍する。85.6 μgのpAAVプラスミドを3 mLの純粋なDMEM培地に再懸濁します。 342 μL の 1 mg/mL PEI 溶液を 3 mL の純粋な DMEM 培地に溶解します。両方の溶液をRTで10分間インキュベートします。 両方の 3 mL チューブを 1 本のチューブに ~6.4 mL のトランスフェクションミックスで混合し、RT で 20 分間インキュベートします。 一方、テトラサイクリン対応の自己サイレンシングヘルパーベクターRepCap6を-80°Cの冷凍庫から37°Cの水浴中で解凍します。293AAV細胞を形質導入するには、組織培養感染量の中央値(TCID 50)を使用し、1.15 x10 7 細胞/皿を仮定して、感染多重度(MOI)25でヘルパーベクターを追加します。通常、15 cmディッシュあたり2〜10 μLが使用されます。皿をそっと揺り動かして回転させて分配します。 トランスフェクションミックスをインキュベーションした後、15 cmディッシュ4枚ずつ1.6 mLずつ滴下します。37°C、5%CO2 で一晩インキュベートします。注:あるいは、目的のrAAV6ベクターがすでに利用可能な場合、これらのベクターを使用してパッケージ化するウイルスゲノムを提供することができ、これにより、このシステムを備えたプラスミドの必要性がなくなり、同等のrAAV6力価が得られます。このアプローチでは、293AAV細胞を、ヘルパーベクターとともに、50のMOI(rAAV6ゲノムコピー[GC]/mLに基づく)で目的のrAAV6と共形質導入します。 翌日、培養液を注意深く吸引して廃棄し、予温した生産培地30 mLと交換します。収穫する前にさらに96時間インキュベートします。歩留まりを最大化するために、これ以上の中程度の変更は推奨されません。 培地からの組換えAAV6の収穫と精製ディッシュから細胞を剥がすことなく、すべての細胞上清を、ろ過する培地の量よりも少なくとも50%大きい0.2 μmのPES膜を備えたフィルターユニットに集めます。次に、上清をろ過する。注:rAAV6のより高い収率が必要な場合は、市販のキットまたは確立されたプロトコルを使用して細胞を回収し、細胞ペレットからrAAVを抽出することができます34,35。AAV6は培地36にほとんど分泌されるため、上清のみを使用し、労力、コスト、および時間を削減しました。 5x PEG/NaCl溶液を、採取した容量の25%でろ過した上清に加えます。30 mLの15 cmディッシュを4つ使用する場合、これは通常30 mLです。 転倒させてよく混合し、4°Cで一晩インキュベートしてウイルス粒子を沈殿させます。注意: AAV粒子は、この溶液で最大2日間安定しています。 250 mLのチューブインサートを備えたスイングバケット遠心分離機を4°Cに予冷します。 各メンブレンを2 mLの10%プルロニックF-68でRTで少なくとも1時間前処理することにより、カットオフが100 kDaの4 mL遠心フィルターユニットと0.22 μmの親水性PESシリンジフィルターを準備します。 AAV-PEG/NaCl混合物を250 mLチューブに移し、2,500 x g で4°Cで1時間遠心分離した後、吸引によって上清全体を慎重に除去します。 完全に再懸濁されるまで4 mLの1 M HEPESにボルテックスすることにより、ベージュから白色のウイルスペレットを再懸濁します。必要に応じて、5分間放置し、再びボルテックスします。5 mL血清学的ピペットを使用して再懸濁し、全容量を15 mLチューブに移します。 ヒュームフードで、ウイルス懸濁液に同量のクロロホルム(通常は4mL)を加えます。 2分間激しくボルテックスした後、RTで1,000 x gで5分間遠心分離します。 最上層(AAV含有上清)を新しい50 mLチューブに集め、最下層(クロロホルム)を廃棄します。注意: クロロホルム含有溶液は有害廃棄物です。その処分のための制度的ガイドラインに従ってください。 AAV含有上清をヒュームフードの下に置き、残りのクロロホルムを30分間蒸発させます。 その間、前処理された遠心フィルターユニットとシリンジフィルターを洗浄します。 前処理された遠心フィルターユニットに1.5 mLの製剤バッファーを追加します。スイングバケットローターで3,500 x g で15°Cで10分間遠心分離します。4 mLの製剤バッファーでこの手順を繰り返し、メンブレンを洗浄します。 5 mLシリンジを使用して、シリンジフィルターを5 mLの製剤バッファーで2回すすぎます。 クロロホルム抽出液からの~4 mLのAAV含有上清を5 mLシリンジにロードし、洗浄したシリンジフィルターを取り付け、遠心フィルターユニットに直接ろ過します。 3,500 x g で15°Cで25分間遠心分離し、フィルター内のAAV溶液が約50〜100 μLであることを確認します。溶液の容量が>100 μLの場合は、遠心分離を続けます。 ろ液を除去した後、遠心フィルターユニットのカップ内に製剤緩衝液4mLを加え、ピペッティングにより溶液を均一に混合する。3,500 x g で15°Cで25分間遠心分離し、フィルター内のAAV溶液が50〜100 μLであることを確認します。溶液の容量が>100 μLの場合は、遠心分離を続けます。別の洗浄のためにこの手順を繰り返します。 最後の遠心分離後、溶液の容量が50〜70μLであることを確認します。そうでない場合は、遠心分離を続けます。調製物を1.5 mLチューブに移します。必要に応じて分注し、-80°Cで保存します。 qPCRによる組換えAAV6力価測定注:qPCRプライマーはITR領域でアニールするため、pAAVにクローニングされたすべてのコンストラクトに適しているはずです。滴定するrAAV6のアリコートとAAV6標準物質のアリコートを解凍します。AAV6標準物質は、4 x 1011 GC / mLに近い必要があります。それ以外の場合は、それに応じて希釈を調整します。 DNase I 消化を行い、2.0 μLのサンプルまたはAAV6標準物質を15.6 μLのヌクレアーゼフリーH 2 O、2.0μLの10x DNase Iバッファー、および0.4 μLのDNase Iと組み合わせることにより、rAAV6調製物に残っている遊離プラスミドDNAを除去します。 穏やかに混合し、37°Cで30分間インキュベートした後、氷に移します。これが希釈1である( 表3参照)。 以下の 表3 のように、すべてのサンプルとAAV6標準物質の5倍段階希釈液を水で調製します。 SYBR グリーン qPCR マスターミックスを準備します。ウェルあたり、4.7 μLのヌクレアーゼフリー水を10 μLのSYBR Greenマスターミックス、0.15 μLのITRプライマーフォワードを100 μM、0.15 μLのITRプライマーリバースを100 μMで混合します。注:各サンプルは、参照標準用に16ウェル、サンプルあたり8ウェル、テンプレートなしコントロール用に2ウェルで、重複して測定されます。ピペッティングエラーを考慮して、マスターミックスを10%多く準備します。 光学 96 ウェルまたは 384 ウェルの反応プレートに、15 μL/ウェルの SYBR Green qPCR マスターミックスをロードします。 次に、5 μLのサンプルとAAV6標準物質またはヌクレアーゼフリーの水をノンテンプレートコントロールにロードします。AAV6参照標準の場合、希釈2を希釈9にロードします。サンプルについては、希釈液5を希釈液8に負荷します。各希釈液を二重に測定します。泡を避けてください。 装填したプレートを光学透明フィルムで密封し、800 x g でRTで1分間遠心分離し、適切な96ウェルまたは384ウェルのセットアップでプレートをqPCR装置にロードします。 次のサイクル条件でSYBR検出を使用してqPCR装置をセットアップして実行します:98°Cで3分間、次に98°Cで15秒間、58°Cで30秒間40サイクル、その後に融解曲線が続きます。 AAV6標準物質のゲノムコピー/ミリメートル(GC/mL)濃度を標準曲線として使用して、機器のソフトウェアでデータを解析します( 表3を参照)。希釈係数を掛けて、サンプルの最終濃度を計算します。 標準曲線R2 が1.0に近く、PCR効率が90%〜110%であり、ベースラインが削除され、融解曲線が単一のピークを示し、Ct 値が希釈に応じて変化し、重複が0.5 Ct以内であることを確認します。それ以外の場合は、外れ値を除外します。 図2のような利回りを期待してください。 2. B細胞培地と刺激の調製 解凍培地の準備:RPMI-1640と20Sを組み合わせます。0.2 μmのPESメンブレンフィルターユニットを通した滅菌フィルター。4°Cで保存してください。 B細胞培養培地の調製: 表4の試薬を合わせ、0.2 μmのPESメンブレンフィルターユニットを通して滅菌フィルターをかけます。4°Cで保存してください。 表5のB細胞刺激剤の各々を、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁すべきCpG ODNを除くB細胞培養培地中のストック濃度で再懸濁する。-80°Cで保存してください。 非B細胞陰性枯渇(オプションのステップ4)を行う場合は、2S(DPBS 2S)でDPBS(カルシウムなし、マグネシウムなし)を調製します。0.2 μmのPESメンブレンフィルターユニットを通した滅菌フィルター。4°Cで保存してください。 3. アカゲザルB細胞の調製と培養 注:凍結保存されたアカゲザルPBMCまたは脾細胞は、細胞培養をセットアップするために使用されます30、31。 解凍培地およびB細胞培養培地を37°Cの水浴中で予め温める。 表5 のB細胞刺激剤を氷上で解凍する。 予熱した解凍媒体を含む適切なサイズのチューブを準備します。これは理想的には解凍した細胞の体積の10倍以上でなければなりません。 PBMCまたは脾細胞のクライオバイアルを37°Cの水浴中で一度に1〜2個解凍し、予熱した培地で調製したチューブにデカントします。クライオチューブをすすぎ、すべての細胞を収集します。 細胞を200 x g でRTで10分間遠心分離します。注:これらの遠心分離設定は、PBMC収量を維持しながら血小板汚染を低減します。350 x g で5分間などの高速を使用できます。 洗浄のために細胞を10 mL解凍培地に再懸濁します。 ステップ3.4とステップ3.5を合計3回の遠心分離で繰り返し、凍結培地を除去します。最後の遠心分離後、B細胞培養培地に推定~5 x 106 細胞/mLで細胞を再懸濁します。注:上記のプロトコルは、PBMCまたは脾細胞調製物全体を他の細胞による汚染で培養します。より純粋なB細胞培養が必要な場合は、総B細胞収量は大幅に低下しますが、ステップ4に進みます。2つの方法間で編集効率に違いは見られませんでした。 必要に応じて10 μLの細胞アリコートをB細胞培養培地で希釈して計数します。血球計算盤およびトリパンブルー染色を用いて計数し、等量の再懸濁細胞とトリパンブルー0.4%溶液を組み合わせる。 細胞数に応じてB細胞培養培地で細胞濃度を3 x 106 cells/mLに調整します。次いで、表 5に記載のB細胞刺激剤をそれらの最終濃度となるように添加し、混合する。 細胞を適切な細胞培養皿に移します。全体的に、0.6 x 10 6-0.7 x 106セル/ cm2が推奨されます。細胞を5%CO2と共に37°Cで48時間±2時間インキュベートする。 4.非B細胞のオプションの負の枯渇 注:収量と純度は、PBMC間のB細胞の投入割合に依存し、個々のアカゲザル間で大幅に異なる可能性があります27。1 x 107 PBMCから80%〜95%の純度、60%の効率、および1 x 10 6-1.5 x10 6セルを期待してください。 最後の洗浄(ステップ3.6)の後、細胞をDPBS 2Sおよび1:200に希釈したヒトFcブロックに1 x 108 細胞/mLで再懸濁します。細胞数は、融解された細胞の数に基づいています。 氷上で15分間インキュベートしてFc受容体を遮断し、 表6のビオチン化抗体を加えます。氷上でさらに20分間インキュベートします。 チューブにDPBS 2% FCSを補充し、200 x g で4°Cで10分間回転させます。 ステップ4.1の体積の80%で細胞をDPBS 2% FCSに再懸濁します(すなわち、1 x 107 細胞あたり80 μL)。 ステップ4.1からの体積の20%で磁気ストレプトアビジンビーズを細胞懸濁液に加える(すなわち、1 x 107 細胞当たり20μLのビーズ)。 細胞を氷上で15分間インキュベートし、時々攪拌します。 一方、1×108セルあたり 、大型の磁気空乏カラムと予備分離フィルターを備えた磁気分離器を用意する。分離前のフィルターとカラムを2 mLのDPBS 2% FCSで重力流によりすすぎ、フロースルーを廃棄します。15 mLの収集チューブを取り付けます。注:ポジティブセレクションカラムや他の磁気ビーズ精製システムなどの他のカラムを使用すると、純度が大幅に低下する可能性があります。 インキュベーション後、容量が<0.5 mLの場合は、DPBS 2% FCSで細胞を0.5 mLに補充します。容量が≥0.5 mLの場合は、そのまま進めてください。 細胞懸濁液を調製カラムの予備分離フィルターにロードし、フロースルーを15 mLチューブに回収します。 1 mLのDPBS 2% FCSを分離前フィルターに加え、未結合の濃縮B細胞を2回溶出します。結合していない細胞を重力流によって同じチューブに集めます。注:追加の溶出により、収量がわずかに増加する可能性があります。純度と効率は、入力細胞、濃縮細胞、およびカラムに保持された細胞のフローサイトメトリーによって評価できます。カラムに保持されているセルを得るには、カラムを磁石から取り外し、付属のプランジャーを使用して3 mLのDPBS 2Sで洗い流します。所望により、表7の試薬を用いて図3のようなフローサイトメトリーにより純度を評価する。 濃縮B細胞を200 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 B細胞培養培地に推定~5 x 106 細胞/mLで細胞を再懸濁し、ステップ3.7に進みます。 5.初代アカゲザルB細胞遺伝子編集 アカゲザルB細胞を48時間±2時間活性化した後、エレクトロポレーションおよび形質導入用の試薬を調製する。DMSO、ヌクレアーゼフリーの二本鎖バッファー、バッファーT、およびバッファーE(10 μLエレクトロポレーションキット)またはE2(100 μLエレクトロポレーションキット)をエレクトロポレーションキットからRTに予熱します。 表5のrAAV6 HDRTおよびB細胞刺激剤を氷上で解凍する。 CRISPR-Cas9 sgRNAを100 μMのデュプレックスバッファーに再懸濁します。RTで10分間再構成し、ボルテックスとフリックで混合します。再構成したsgRNAは、使用するまで氷上に保管してください。-80°Cで保存してください。注:CRISPR-Cas9 sgRNAは、さまざまなオンラインツール(1.1.1を参照)で設計でき、切断効率が大幅に異なる場合があります。切断効率の実証的試験は、TIDE37 やICE38などのアッセイを使用して推奨されます。 10 μLエレクトロポレーションあたり、表5のすべての刺激剤を含む550 μLのB細胞培養培地を調製し、1%DMSOを添加します。100 μLのエレクトロポレーション用に容量を10倍にスケーリングします。場合により、この培地の10%を抗生物質 – 抗真菌剤なしで調製することができ、これはトランスフェクション後の細胞生存率をわずかに増加させる。 10 μLのエレクトロポレーションごとに、50 μLのB細胞培養培地に刺激剤を使用し、抗生物質抗真菌剤を使用しない48ウェル細胞培養プレートのウェルを調製します。100 μLのエレクトロポレーションの場合、500 μLを6ウェルプレートのウェルにピペットで入れます。 rAAV6 HDRTをウェル内の培地に添加し、ウェル内の体積の最大20%まで添加します。トランスフェクションあたりの細胞数(10 μLエレクトロポレーション:5 x 10 5細胞、100 μLエレクトロポレーション:5 x 106細胞)およびrAAV6調製液中のGCに基づいて、1 x 105-1 x 106の範囲のMOIを目指します。低容量で高MOIを達成するには、5 x 1013 GC/mLから5 x 1014 GC/mLの高rAAV6ストック濃度が推奨されます。注:MOIが低いと編集効率が低下する可能性があり、5 x 105 のMOIは一般的にこれまでに見た最大編集効率に近いです。B細胞の生存率に対するMOIの変化の影響は観察されていません。rAAV6 HDRTなし、RNPトランスフェクションなし、および両方なしのコントロールを含めることをお勧めします。 準備した皿と残りの培地を5%CO2を含む37°Cのインキュベーターに移して予熱します。 10 μLエレクトロポレーションごとに、1.15 μLのリボ核タンパク質(RNP)を調製します:0.4 μLの61 μM Cas9と0.75 μLの100 μM sgRNAを二重鎖バッファーで混合します。ピペッティングエラーのために余分に準備し(1回のエレクトロポレーションで30%以上を推奨)、エレクトロポレーションチップをロードする際の気泡を避けます。100 μLのチップで10倍にスケールします。 RNPをRTで少なくとも15分間インキュベートしてから、細胞と混合します。インキュベーション後、複数の遺伝子座を同時に標的にする場合は、複数のRNPを組み合わせることができます。同時に最大3つの遺伝子座で効率に大きな違いは観察されていません。 その間、エレクトロポレーション用のセルを準備します。温度ショックを避けるために、セルを常にRTに保ちます。培養の48時間±2時間後に細胞を適切な容器に回収します。最大数の細胞を集めるためにDPBSで皿をすすぎます。 細胞を200 x g でRTで10分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を~2 x 106 細胞/mLのDPBSに再懸濁します。 10 μLのトリパンブルー0.4%溶液と10 μLの細胞懸濁液を組み合わせ、血球計算盤を使用してカウントします。注:この時点で、収穫および洗浄中の損失により、48時間±2時間早く培養された細胞の約60%が予想されます。 その間、細胞を200 x g でRTで10分間遠心分離し、上清を廃棄し、残っているDPBSを最小限に抑えるようにします。上記の細胞数に基づいて、5.55 x 107 細胞/mLの予熱(RT)バッファーTに細胞を再懸濁します。 トランスフェクションシステムを設定するには、マシンの電源を入れ、1,350 V、15 ms、1パルスに設定します。ピペットステーションを層流フード内に置きます 10 回のエレクトロポレーションセットごとに、3 mL のバッファー E(10 μL トランスフェクションの場合)または E2 (100 μL トランスフェクションの場合) を含むトランスフェクションチューブを調製します。チューブをピペットステーションに挿入します。 10 μLのエレクトロポレーションごとに、1.15 μLのRNPと9 μLの細胞を組み合わせます。エレクトロポレーションチップに空気が吸引されないように、十分な量(+ 30%)があることを確認してください。エレクトロポレーションの前にRTで1〜2分間インキュベートします。 10 μLまたは100 μLのRNPと細胞混合物をエレクトロポレーションピペットの適切なサイズのエレクトロポレーションチップに吸引し、ロードしたピペットをピペットステーションに挿入して、エレクトロポレーションを開始します。アーク放電を防ぐために、チップに気泡が完全にないことを確認してください。エレクトロポレーション中に監視して、アーク放電が発生しないことを確認します。 エレクトロポレーションした細胞を、48ウェル(10 μLトランスフェクション)または6ウェルプレート(100 μLトランスフェクション)内のrAAV6の有無にかかわらず、調製し、予熱した少量の培地に直ちに排出します。残りのサンプルで手順5.15〜5.17を繰り返します。トランスフェクションなしでコントロールサンプルを培養ウェルに追加します。 細胞を5%CO2 で37°Cで4時間±2時間インキュベートし、次に、刺激剤、DMSO、および抗生物質/抗真菌剤を含む調製し、予熱したB細胞培養培地を加えます:10 μLトランスフェクションの場合は450 μL、100 μLトランスフェクションの場合は4.5 mL。 5%CO2を用いて37°Cで12 〜24時間インキュベーションを続ける。その後、長期培養が必要な場合は、刺激剤と抗生物質/抗真菌剤を含まないB細胞培養培地に変更してください。ゲノムDNAの分析は24時間後に行うことができます。相同性アームの外側のプライマーおよびインサート内のプライマーを用いたデジタルドロップレットPCRは、編集効率を定量するために使用することができる39。PCRを実行して挿入部位を増幅し、サンガーシーケンシングを実行して正しい編集を確認します。 タンパク質レベルの分析のために、エレクトロポレーション後に40〜48時間細胞を培養してタンパク質発現変化を許容し、 表7の試薬を用いてフローサイトメトリーによる分析を行った。