Édition génique de cellules primaires de macaque rhésus B

Toutes les procédures et expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, National Institutes of Health. Un résumé des protocoles suivants est présenté à la figure 1. Les macaques rhésus mâles et femelles (Macaca mulatta) d’origine génétique indienne âgés de 2 à 8 ans ont été hébergés et soignés conformément aux directives du Comité sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire dans une installation de niveau de biosécurité 2. ATTENTION : Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux précautions universelles pour les agents pathogènes transmissibles par le sang, avec des techniques stériles/aseptiques et un équipement de niveau de biosécurité 2 approprié dans des hottes à flux laminaire. 1. Production de rAAV6 Préparer les réactifs pour la production de rAAV6.Concevoir et cloner le modèle de réparation dirigé par homologie entre les répétitions terminales inversées (ITR) d’AAV2 dans le pAAV vectoriel à l’aide de techniques standard. Assurez-vous que les bras d’homologie sont d’au moins ~250 pb de chaque côté, mais aussi peu que 60 pb peuvent suffire, bien que des bras d’homologie plus longs soient préférés si la conception de la construction le permet. Si des séquences cibles de l’un des ARNg utilisés sont présentes dans le HDRT, retirez-les en utilisant des mutations silencieuses, qui sont plus efficaces dans le motif adjacent protospacer ou la région semencière du site cible.REMARQUE: La synthèse de gènes combinée à l’assemblage Gibson pour un clonage efficace32 peut être effectuée. Préparez un Maxiprep d’un clone correct pour la transfection. Pour la conception de sgRNA, CHOPCHOP33 est recommandé, et une liste d’autres outils peut être trouvée à https://zlab.bio/guide-design-resources. La capacité maximale d’emballage de l’AAV, y compris le RTI, est de ~4,7 kb. AAV6 est le sérotype le plus couramment utilisé pour modifier les cellules hématopoïétiques, en particulier les cellules B9. D’autres sérotypes d’AAV pour l’édition de gènes de cellules B de macaque rhésus n’ont pas été testés, mais AAV28 et AAV-DJ10,11 ont été utilisés dans des études sur la souris. Préparer le milieu de culture 293AAV et le milieu de production conformément aux tableaux 1 et 2. Filtre stérile à travers une unité de filtration à membrane en polyéthersulfone (PES) de 0,2 μm. Conserver à 4 °C. Préparer 1x solution de polyéthylènemine (PEI) (1 mg/mL, 100 mL). Dans un bécher en verre de 250 mL, chauffer ~ 70 mL deH2Oau micro-ondes pendant ~30 s, puis ajouter 100 mg d’IPE. Ajouter un agitateur magnétique et remuer jusqu’à ce que le PEI soit en grande partie dissous. Ajuster le pH à 7 avec 1 M HCl, puis compléter à 100 mL avec H2O, attendre 10 min, vérifier à nouveau le pH et ajuster si nécessaire. Filtrer stérile la solution PEI à travers une unité de filtration à membrane PES de 0,2 μm, aliquote, et stocker −20 °C. Après décongélation, la solution peut être conservée à 4 °C jusqu’à 2 mois. Préparer 5x solution de polyéthylèneglycol (PEG)/NaCl. Peser 400 g de PEG 8 000 et 24 g de NaCl. Ajouter un agitateur magnétique à un bécher en verre de 2 L, ajouter le PEG 8 000 pesé et le NaCl, et rincer avec ~ 550 mL d’eau désionisée. Remuer avec le chauffage et porter à ébullition ou à 80-90 °C jusqu’à dissolution complète. Ajustez le pH à ~7,4 avec 1 M NaOH, puis réglez le volume à 1 L à l’aide d’un cylindre de mesure et transférez-le dans une bouteille en verre de 2 L avec l’agitateur magnétique. Autoclaver le flacon, l’agitateur magnétique et la solution au bain-marie pendant 30 min à 121 °C. Après l’autoclavage, refroidir la solution dans une chambre froide tout en agitant à l’aide de l’agitateur magnétique pour éviter la séparation en différentes phases. Aliquote si nécessaire et conserver à 4 °C. Préparer le tampon de formulation. Mélanger 500 mL de DPBS avec 50 μL de 10% de Pluronic F-68. Filtre stérile à travers une unité de filtration à membrane PES de 0,2 μm et stockage à température ambiante (RT). Culture cellulaire, transfection et transduction pour la production de rAAV6Décongeler, mettre en culture et congeler les cellules 293AAV comme décrit par le fabricant en utilisant le milieu de culture 293AAV ci-dessus et la trypsine-EDTA pour le fractionnement. Il est recommandé de congeler certains passages précoces et d’utiliser les cellules pour la production d’AAV avant qu’elles n’atteignent le passage 40. Pour la production de rAAV6, ensemencez quatre boîtes de culture cellulaire de 15 cm contenant 5 x 106 cellules dans 30 ml chacune. Les cellules sont prêtes pour la transfection généralement 1-2 jours après l’ensemencement quand elles atteignent 80%-90% de confluence. Décongeler un Maxiprep de plasmide pAAV contenant le HDRT à emballer dans AAV6. Resuspendre 85,6 μg du plasmide pAAV dans 3 mL de milieu DMEM pur. Dissoudre 342 μL de solution de PEI à 1 mg/mL dans 3 mL de milieu DMEM pur. Incuber les deux solutions pendant 10 min à TA. Mélanger les deux tubes de 3 mL dans un tube de ~6,4 mL de mélange de transfection et incuber pendant 20 minutes à TA. Pendant ce temps, décongeler le vecteur auxiliaire auto-silencieux activé par la tétracycline RepCap6 du congélateur à -80 °C dans un bain-marie à 37 °C. Pour transduire les cellules 293AAV, ajouter le vecteur auxiliaire à une multiplicité d’infection (MOI) de 25 en utilisant la dose infectieuse médiane de culture tissulaire (TCID 50) et en supposant 1,15 x10 7 cellules/boîte; typiquement, 2-10 μL est utilisé par boîte de 15 cm. Bercer et faire tourner doucement les plats pour les distribuer. Après l’incubation du mélange de transfection, ajoutez-en 1,6 ml goutte à goutte sur chacune des quatre boîtes de 15 cm. Incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant une nuit.NOTE: Alternativement, si les vecteurs rAAV6 d’intérêt sont déjà disponibles, ces vecteurs peuvent être utilisés pour fournir le génome viral à emballer, ce qui élimine le besoin de plasmides avec ce système et donne des titres rAAV6 comparables. Pour cette approche, les cellules 293AAV sont co-transduites avec le rAAV6 souhaité à un MOI de 50 (basé sur les copies du génome rAAV6 [GC]/mL) avec le vecteur auxiliaire. Le lendemain, aspirer et jeter soigneusement le milieu de culture, et le remplacer par 30 ml de milieu de production préchauffé. Incuber pendant encore 96 h avant la récolte. Aucun autre changement moyen n’est recommandé pour maximiser les rendements. Récolte et purification de l’AAV6 recombinant à partir du milieuSans déloger les cellules de la boîte, rassembler tout le surnageant cellulaire dans une unité filtrante avec une membrane PES de 0,2 μm au moins 50% plus grande que le volume de milieu à filtrer. Ensuite, filtrez le surnageant.NOTE: Si des rendements plus élevés de rAAV6 sont souhaités, les cellules peuvent être récoltées et le rAAV extrait de la pastille cellulaire à l’aide de kits commerciaux ou de protocoles établis34,35. Étant donné que l’AAV6 est principalement sécrété dans le milieu36, seul le surnageant a été utilisé, ce qui a réduit la main-d’œuvre, les coûts et le temps. Ajouter 5x solution de PEG/NaCl au surnageant filtré à 25% du volume collecté; il s’agit généralement de 30 ml si quatre boîtes de 15 cm de 30 ml sont utilisées. Bien mélanger en inversant, puis incuber pendant une nuit à 4 °C pour précipiter les particules virales.REMARQUE: Les particules AAV sont stables jusqu’à 2 jours dans cette solution. Prérefroidir une centrifugeuse à godet pivotant avec 250 ml d’inserts de tube à 4 °C. Préparer une unité de filtration centrifuge de 4 mL avec une coupure de 100 kDa et une seringue en PES hydrophile de 0,22 μm en prétraitant chaque membrane avec 2 mL de F-68 pluronique à 10 % pendant au moins 1 h à TA. Transférer le mélange AAV-PEG/NaCl dans un tube de 250 mL, centrifuger à 2 500 x g pendant 1 h à 4 °C, puis retirer délicatement le surnageant entier par aspiration. Resuspendre la pastille virale beige à blanche en tourbillonnant dans 4 mL de HEPES 1 M jusqu’à ce qu’elle soit complètement remise en suspension. Si nécessaire, laissez-le reposer pendant 5 minutes et vortex à nouveau. Remettez en suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml et transférez le volume total dans un tube de 15 ml. Dans une hotte, ajouter un volume égal de chloroforme à la suspension virale, généralement 4 mL. Tourbillonner vigoureusement pendant 2 min, puis centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à TA. Recueillir la couche supérieure (surnageant contenant de l’AAV) dans un nouveau tube de 50 mL et jeter la couche inférieure (chloroforme).ATTENTION : Les solutions contenant du chloroforme sont des déchets dangereux. Suivre les lignes directrices de l’établissement pour son élimination. Placer le surnageant contenant de l’AAV sous une hotte et laisser le chloroforme restant s’évaporer pendant 30 min. Pendant ce temps, lavez l’unité de filtration centrifuge prétraitée et le filtre à seringue. Ajouter 1,5 mL de tampon de formulation à l’unité de filtration centrifuge prétraitée. Centrifuger à 3 500 x g pendant 10 min à 15 °C dans un rotor à godet oscillant. Répétez cette étape avec 4 mL de tampon de formulation pour laver la membrane. Rincer le filtre de la seringue deux fois avec 5 mL de tampon de formulation à l’aide d’une seringue de 5 mL. Charger le surnageant contenant du virus AAV ~4 mL provenant de l’extraction du chloroforme dans une seringue de 5 mL, fixer le filtre de la seringue lavée et filtrer directement dans l’unité de filtration centrifuge. Centrifuger à 3 500 x g pendant 25 min à 15 °C, puis confirmer que la solution AAV dans le filtre est comprise entre 50 et 100 μL. Si le volume de la solution est de > 100 μL, poursuivre la centrifugation. Après avoir retiré le filtrat, ajouter 4 mL de tampon de formulation à l’intérieur de la tasse de l’unité de filtration centrifuge et mélanger la solution uniformément par pipetage. Centrifuger à 3 500 x g pendant 25 min à 15 °C, puis confirmer que la solution AAV dans le filtre est comprise entre 50 et 100 μL. Si le volume de la solution est de > 100 μL, poursuivre la centrifugation. Répétez cette étape pour un autre lavage. Après la centrifugation finale, confirmer que le volume de la solution est de 50-70 μL; Si ce n’est pas le cas, continuez à centrifuger. Transférer la préparation dans un tube de 1,5 mL. Aliquote si désiré et conserver à −80 °C. Détermination du titre AAV6 recombinant par qPCRNOTE: Les amorces qPCR sont recuites dans la région ITR et devraient donc convenir à toutes les constructions clonées en pAAV.Décongeler une partie aliquote du rAAV6 à titrer et une partie aliquote du matériau de référence AAV6. Le matériau de référence AAV6 doit être proche de 4 x 1011 GC/mL; sinon, ajuster les dilutions en conséquence. Effectuer une digère de DNase I pour éliminer tout ADN plasmidique libre restant dans la préparation rAAV6 en combinant 2,0 μL de l’échantillon ou du matériau de référence AAV6 avec 15,6 μL deH2Osans nucléase, 2,0 μL de tampon 10x DNase I et 0,4 μL de DNase I. Mélanger et incuber doucement pendant 30 min à 37 °C, puis transférer sur la glace. Il s’agit de la dilution 1 (voir tableau 3). Préparer avec de l’eau des dilutions en série quintuples de tous les échantillons et du matériau de référence AAV6 comme indiqué dans le tableau 3 ci-dessous. Préparez un mélange maître qPCR vert SYBR. Par puits, mélanger 4,7 μL d’eau exempte de nucléases avec 10 μL de mélange maître SYBR Green, 0,15 μL d’amorce ITR vers l’avant à 100 μM et 0,15 μL d’amorce ITR inverse à 100 μM.REMARQUE : Chaque échantillon est mesuré en double, avec 16 puits pour l’étalon de référence, 8 puits par échantillon et 2 puits pour un contrôle sans gabarit. Préparez 10 % de mélange principal supplémentaire pour tenir compte des erreurs de pipetage. Dans une plaque de réaction optique à 96 puits ou 384 puits, charger 15 μL/puits du mélange maître qPCR vert SYBR. Ensuite, chargez 5 μL d’échantillons et de matériau de référence AAV6 ou d’eau sans nucléase pour le contrôle sans gabarit. Pour l’étalon de référence AAV6, dilution de charge 2 à dilution 9. Pour les échantillons, dilution de charge 5 à dilution 8. Mesurer chaque dilution en double. Évitez les bulles. Scellez la plaque chargée avec un film transparent optique, centrifugez à 800 x g pendant 1 min à RT et chargez la plaque dans l’instrument qPCR avec la configuration appropriée à 96 puits ou 384 puits. Configurez et exécutez l’instrument qPCR à l’aide de la détection SYBR dans les conditions de cyclage suivantes : 98 °C pendant 3 min, puis 40 cycles de 98 °C pendant 15 s et 58 °C pendant 30 s, suivis d’une courbe de fusion. Analyser les données à l’aide du logiciel de l’instrument en utilisant la concentration du matériau de référence AAV6 en copies génomiques par millimètre (GC/mL) comme courbe standard (voir le tableau 3). Calculer la concentration finale de l’échantillon en multipliant par le facteur de dilution. S’assurer que la courbe standard R2 est proche de 1,0, que l’efficacité de la PCR est de 90 % à 110 %, que la ligne de base a été supprimée, que la courbe de fusion montre un seul pic, que les valeurs C t changent en fonction des dilutions et que les doublons sont à moins de 0,5 Ct; sinon, excluez les valeurs aberrantes. Attendez-vous à des rendements comme dans la figure 2. 2. Préparation des milieux et des stimuli des cellules B Préparer le milieu de décongélation : Combiner le RPMI-1640 avec 20 % de FCS. Filtre stérile à travers une unité de filtration à membrane PES de 0,2 μm. Conserver à 4 °C. Préparer le milieu de culture de cellules B : Combiner les réactifs du tableau 4, puis filtrer stérile à travers une unité filtrante à membrane PES de 0,2 μm. Conserver à 4 °C. Remettre en suspension chacun des stimulants des lymphocytes B du tableau 5 à des concentrations mères dans le milieu de culture de cellules B, à l’exception de l’ODN CpG qui doit être remis en suspension dans de l’eau exempte de nucléase. Conserver à −80 °C. Si vous effectuez une déplétion négative des cellules non B (étape 4 facultative), préparez DPBS (sans calcium, sans magnésium) avec 2% FCS (DPBS 2% FCS). Filtre stérile à travers une unité de filtration à membrane PES de 0,2 μm. Conserver à 4 °C. 3. Préparation et culture de cellules B de macaque rhésus NOTE: Des PBMC ou des splénocytes de macaque rhésus cryoconservés sont utilisés pour mettre en place la culture cellulaire30,31. Préchauffer le milieu de décongélation et les milieux de culture de cellules B au bain-marie à 37 °C. Décongeler les stimulants des cellules B du tableau 5 sur la glace. Préparer un tube de taille appropriée contenant un milieu de décongélation préchauffé. Cela devrait idéalement être plus de 10 fois le volume des cellules décongelées. Décongeler un à deux cryoflacons de PBMC ou de splénocytes à la fois dans un bain-marie à 37 °C et décanter dans le tube préparé avec un milieu préchauffé. Rincez les cryotubes pour recueillir toutes les cellules. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 10 min à TA.REMARQUE: Ces paramètres de centrifugation réduisent la contamination plaquettaire tout en préservant les rendements PBMC. Des vitesses plus élevées telles que 350 x g pendant 5 minutes peuvent être utilisées. Remettez les cellules en suspension dans un milieu de décongélation de 10 ml pour le lavage. Répétez les étapes 3.4 et 3.5 pour un total de trois centrifugations afin d’éliminer le milieu de congélation. Après la dernière centrifugation, remettre les cellules en suspension à une température estimée de ~5 x 106 cellules/ml dans un milieu de culture de cellules B.REMARQUE: Le protocole ci-dessus cultive des préparations entières de PBMC ou de splénocytes contaminées par d’autres cellules. Si des cultures de cellules B plus pures sont nécessaires, bien qu’à des rendements totaux de cellules B significativement réduits, passez à l’étape 4. Aucune différence n’a été observée dans l’efficacité de la révision entre les deux méthodes. Diluer une partie aliquote de 10 μL de cellules au besoin avec un milieu de culture de cellules B pour le comptage. Compter à l’aide d’un hémocytomètre et d’une coloration au bleu de trypan, en combinant des volumes égaux de cellules remises en suspension et une solution de bleu de trypan à 0,4%. Ajuster la concentration cellulaire à 3 x 106 cellules/ml avec le milieu de culture de cellules B en fonction du nombre de cellules. Ensuite, ajoutez les stimulants des cellules B à leurs concentrations finales conformément au tableau 5 et mélangez. Transférer les cellules dans une boîte de culture cellulaire appropriée. Dans l’ensemble, 0,6 x 10 6-0,7 x 106 cellules/cm2 est recommandé. Incuber les cellules à 37 °C avec 5% de CO 2 pendant 48 h ±2 h. 4. Déplétion négative facultative des cellules non-B NOTE: Le rendement et la pureté dépendent du pourcentage d’entrée de cellules B parmi les PBMC, qui peut différer considérablement d’un macaque rhésusindividuel 27. Attendez-vous à une pureté de 80% à 95%, à une efficacité de 60% et à 1 x 10 6-1,5 x 106 cellules à partir de 1 x 107 PBMC. Après le dernier lavage (étape 3.6), remettre les cellules en suspension à 1 x 108 cellules/ml dans du bloc FCS à 2 % de DPBS et du bloc Fc humain dilué 1:200. Le nombre de cellules est basé sur le nombre de cellules décongelées. Incuber pendant 15 minutes sur de la glace pour bloquer les récepteurs Fc, puis ajouter les anticorps biotinylés dans le tableau 6. Incuber pendant encore 20 minutes sur la glace. Remplir le tube avec du DPBS 2% FCS et faire tourner à 200 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettez en suspension les cellules dans DPBS 2% FCS à 80% du volume de l’étape 4.1 (c.-à-d. 80 μL par 1 x 107 cellules). Ajouter des billes magnétiques de streptavidine à la suspension cellulaire à 20 % du volume de l’étape 4.1 (c.-à-d. 20 μL de billes par 1 x 107 cellules). Incuber les cellules pendant 15 minutes sur de la glace et agiter de temps en temps. Pendant ce temps, par 1 x 108 cellules, préparez un séparateur magnétique avec une grande colonne d’épuisement magnétique et un filtre de pré-séparation. Rincer le filtre et la colonne de préséparation avec 2 ml de DPBS 2 % FCS par gravité et jeter l’écoulement continu. Installez un tube de prélèvement de 15 mL.REMARQUE: L’utilisation d’autres colonnes telles que des colonnes de sélection positive ou d’autres systèmes de purification de billes magnétiques peut réduire considérablement la pureté. Après l’incubation, compléter les cellules à 0,5 mL avec DPBS 2% FCS si le volume est de <0,5 mL. Si le volume est de ≥0,5 mL, continuez simplement. Chargez la suspension cellulaire dans le filtre de préséparation de la colonne préparée et recueillez le débit dans le tube de 15 mL. Éluer deux fois les cellules B enrichies non liées en ajoutant 1 mL de DPBS 2% FCS dans le filtre de pré-séparation. Recueillir les cellules non liées dans le même tube par écoulement gravitaire.NOTE: Une élution supplémentaire peut augmenter légèrement le rendement. La pureté et l’efficacité peuvent être évaluées par la cytométrie en flux des cellules d’entrée, des cellules enrichies et des cellules retenues sur la colonne. Pour obtenir les cellules retenues sur la colonne, retirez la colonne de l’aimant et rincez avec 3 ml de DPBS 2% FCS à l’aide du piston fourni. Si vous le souhaitez, évaluer la pureté par cytométrie en flux comme dans la figure 3 en utilisant les réactifs du tableau 7. Centrifuger les lymphocytes B enrichis à 200 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettez les cellules en suspension à une température estimée ~5 x 106 cellules/mL dans un milieu de culture de cellules B et continuez à l’étape 3.7. 5. Édition du gène primaire des cellules B du macaque rhésus Après avoir activé les cellules B du macaque rhésus pendant 48 h ± 2 h, préparer les réactifs pour l’électroporation et la transduction.Préchauffer le DMSO, le tampon duplex sans nucléase, le tampon T et le tampon E (kit d’électroporation de 10 μL) ou E2 (kit d’électroporation de 100 μL) du kit d’électroporation à RT. Décongeler les stimulants rAAV6 HDRT et B du tableau 5 sur la glace. Resuspendre les sgRNAs CRISPR-Cas9 à 100 μM dans un tampon duplex. Reconstituer pendant 10 min à TA, et mélanger en tourbillonnant et en effleurant. Gardez les sgRNA reconstitués sur la glace jusqu’à utilisation. Conserver à −80 °C.REMARQUE: Les sgRNA CRISPR-Cas9 peuvent être conçus avec divers outils en ligne (voir 1.1.1) et peuvent varier considérablement dans leur efficacité de coupe. Des tests empiriques de l’efficacité de coupe sont recommandés à l’aide de tests tels que TIDE37 ou ICE38. Par électroporation de 10 μL, préparer 550 μL de milieu de culture de cellules B avec tous les stimulants du tableau 5 et ajouter 1 % de DMSO. Multipliez les volumes par 10 pour des électroporations de 100 μL. En option, 10% de ce milieu peut être préparé sans antibiotique-antimycotique, ce qui augmente légèrement la viabilité cellulaire après la transfection. Par électroporation de 10 μL, préparer un puits d’une plaque de culture cellulaire de 48 puits avec 50 μL de milieu de culture de cellules B avec des stimulants et sans antibiotique-antimycotique, si vous l’utilisez. Pour les électroporations de 100 μL, pipeter 500 μL dans les puits d’une plaque de 6 puits. Ajouter rAAV6 HDRT au milieu dans les puits, jusqu’à 20% du volume dans le puits. Visez des MOI allant de 1 x 10 5-1 x 10 6 en fonction du nombre de cellules par transfection (électroporation de 10 μL : 5 x 10 5 cellules ; électroporation de 100 μL :5 x 106 cellules) et de la GC dans la préparation rAAV6. Des concentrations élevées de stock de rAAV6 de 5 x 1013 GC/mL à 5 x 1014 GC/mL sont recommandées pour obtenir des MOI élevés avec de faibles volumes.REMARQUE: Des MOI plus faibles peuvent entraîner une réduction de l’efficacité de l’édition, et des MOI de 5 x 105 sont généralement proches de l’efficacité maximale de l’édition que nous avons observée. Aucune influence de la variation des MOI sur la viabilité des lymphocytes B n’a été observée. Il est recommandé d’inclure des témoins sans rAAV6 HDRT, sans transfection RNP et sans les deux. Préchauffer les plats préparés et le milieu restant en les transférant dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2. Par électroporation de 10 μL, préparer 1,15 μL de ribonucléoprotéine (RNP) : Mélanger 0,4 μL de Cas9 61 μM avec 0,75 μL d’ARNg 100 μM dans un tampon duplex. Préparez un supplément (30% de plus pour une seule électroporation est recommandé) en raison d’une erreur de pipetage et pour éviter les bulles lors du chargement des pointes d’électroporation. Échelle 10 fois pour des pointes de 100 μL. Incuber le RNP pendant au moins 15 min à TA avant de le mélanger avec les cellules. Après l’incubation, plusieurs RNP peuvent être combinés si plus d’un locus doit être ciblé simultanément. Aucune différence significative d’efficacité n’a été observée avec jusqu’à trois loci en même temps. Pendant ce temps, préparez les cellules pour l’électroporation. Gardez les cellules à TA en tout temps pour éviter les chocs de température. Récolter les cellules après 48 h ± 2 h de culture dans un récipient approprié. Rincez la vaisselle avec du DPBS pour recueillir le maximum de cellules. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 10 min à TA. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans DPBS à ~2 x 106 cellules/mL. Combiner 10 μL de solution de bleu de trypan à 0,4% avec 10 μL de suspension cellulaire et compter à l’aide d’un hémocytomètre.REMARQUE: À ce stade, en raison de la perte pendant la récolte et le lavage, attendez-vous à environ 60% des cellules qui ont été mises en culture 48 h ± 2 heures plus tôt. Pendant ce temps, centrifuger les cellules à 200 x g pendant 10 min à TA. Jetez le surnageant, en veillant à minimiser les DPBS restants. Resuspendre les cellules dans un tampon T préchauffé (RT) à 5,55 x 107 cellules/mL en fonction du nombre de cellules ci-dessus. Configurez le système de transfection en allumant la machine et en la réglant sur 1 350 V, 15 ms et 1 impulsion. Placez la station de pipette à l’intérieur de la hotte à flux laminaire Pour chaque série de 10 électroporations, préparer un tube de transfection avec 3 mL de tampon E (pour 10 μL de transfections) ou E2 (pour 100 μL de transfections). Insérez le tube dans la station de pipette. Par électroporation de 10 μL, combiner 1,15 μL de RNP avec 9 μL de cellules. Assurez-vous d’avoir un volume suffisant (+ 30%) pour éviter d’aspirer de l’air dans l’embout d’électroporation. Incuber à TA pendant 1-2 min avant l’électroporation. Aspirer 10 μL ou 100 μL de RNP et de mélange cellulaire dans l’embout d’électroporation de taille appropriée sur une pipette d’électroporation, insérer la pipette chargée dans la station de pipette et démarrer l’électroporation. Assurez-vous que les embouts sont complètement exempts de bulles d’air pour éviter les arcs électriques. Surveillez pendant l’électroporation pour vérifier qu’il n’y a pas d’arc électrique. Éjecter immédiatement les cellules électroporées dans le petit volume de milieu préparé et préchauffé avec ou sans rAAV6 à l’intérieur de la plaque de 48 puits (transfections de 10 μL) ou de 6 puits (transfections de 100 μL). Répétez les étapes 5.15 à 5.17 avec les échantillons restants. Ajouter des échantillons témoins sans transfection dans les puits de culture. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO 2 pendant 4 h ±2 h, puis ajouter le milieu de culture de cellules B préparé et préchauffé contenant des stimulants, du DMSO et des antibiotiques/antimycotiques : 450 μL pour les transfections de 10 μL ou 4,5 mL pour les transfections de 100 μL. Poursuivre l’incubation à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 12-24 h. Ensuite, changez le milieu en milieu de culture de cellules B contenant des stimulants et des antibiotiques / antimycotiques sans DMSO si une culture prolongée est souhaitée. L’analyse de l’ADN génomique peut être effectuée après 24 heures. La PCR numérique par gouttelettes utilisant une amorce à l’extérieur du bras d’homologie et une amorce à l’intérieur de l’insert peut être utilisée pour quantifier l’efficacité d’édition39. Effectuez des PCR pour amplifier le site d’insertion et le séquençage de Sanger pour vérifier l’édition correcte. Pour l’analyse des niveaux de protéines, cultiver les cellules pendant 40 à 48 heures après l’électroporation pour permettre des changements d’expression protéique, et effectuer une analyse par cytométrie en flux à l’aide des réactifs du tableau 7.