Editing genetico delle cellule B del macaco rhesus primario

Tutte le procedure e gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Istituto nazionale di allergie e malattie infettive, National Institutes of Health. Un riepilogo dei seguenti protocolli è presentato nella Figura 1. Macachi rhesus maschi e femmine (Macaca mulatta) di origine genetica indiana di età compresa tra 2 e 8 anni sono stati ospitati e curati in conformità con le linee guida del Comitato per la cura e l’uso degli animali da laboratorio in una struttura di livello di biosicurezza 2. ATTENZIONE: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le precauzioni universali per i patogeni trasmessi per via ematica, con tecniche sterili / asettiche e adeguate apparecchiature di livello di biosicurezza 2 in cappe a flusso laminare. 1. Produzione di rAAV6 Preparare i reagenti per la produzione di rAAV6.Progettare e clonare il modello di riparazione diretto dall’omologia tra le ripetizioni terminali invertite (ITR) di AAV2 nel vettore pAAV utilizzando tecniche standard. Assicurarsi che i bracci di omologia siano di almeno ~ 250 bp su entrambi i lati, ma un minimo di 60 bp può essere sufficiente, anche se i bracci di omologia più lunghi sono preferiti se il design del costrutto lo consente. Se le sequenze bersaglio di uno qualsiasi degli sgRNA utilizzati sono presenti nell’HDRT, rimuoverle usando mutazioni silenti, che sono più efficaci nel motivo adiacente del protospaziatore o nella regione del seme del sito bersaglio.NOTA: È possibile eseguire la sintesi genica combinata con l’assemblaggio Gibson per una clonazione efficiente32. Preparare un Maxiprep di un clone corretto per la trasfezione. Per la progettazione di sgRNA, CHOPCHOP33 è raccomandato e un elenco di altri strumenti può essere trovato su https://zlab.bio/guide-design-resources. La capacità massima di packaging per AAV inclusi ITR è ~4.7 kb. AAV6 è il sierotipo più comunemente usato per l’editing delle cellule ematopoietiche, in particolare le cellule B9. Altri sierotipi di AAV per l’editing genico delle cellule B del macaco rhesus non sono stati testati, ma AAV28 e AAV-DJ10,11 sono stati utilizzati negli studi sui topi. Preparare il terreno di coltura 293AAV e il terreno di produzione secondo la Tabella 1 e la Tabella 2. Filtro sterile attraverso un’unità filtrante a membrana in polietersulfone (PES) da 0,2 μm. Conservare a 4 °C. Preparare 1x soluzione di polietilenimina (PEI) (1 mg/ml, 100 ml). In un becher di vetro da 250 ml, riscaldare ~ 70 mL di H2O in un forno a microonde per ~30 s, quindi aggiungere 100 mg di PEI. Aggiungere un agitatore magnetico e mescolare fino a quando il PEI è in gran parte sciolto. Regolare il pH a 7 con 1 M HCl, quindi rabboccare fino a 100 ml con H2O, attendere 10 minuti, controllare nuovamente il pH e regolare se necessario. Filtrare sterile la soluzione PEI attraverso un’unità filtrante a membrana PES da 0,2 μm, aliquota e conservare -20 °C. Dopo lo scongelamento, la soluzione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 2 mesi. Preparare una soluzione 5x di polietilenglicole (PEG)/NaCl. Pesare 400 g di PEG 8.000 e 24 g di NaCl. Aggiungere un agitatore magnetico a un becher di vetro da 2 litri, aggiungere il PEG 8.000 pesato e NaCl e risciacquare con ~ 550 ml di acqua deionizzata. Mescolare con il riscaldamento e portare a ebollizione o 80-90 °C fino a completa dissoluzione. Regolare il pH a ~ 7,4 con 1 M NaOH, quindi regolare il volume a 1 L utilizzando un cilindro graduato e trasferirlo in una bottiglia di vetro da 2 L con l’agitatore magnetico. Autoclavare il flacone, l’agitatore magnetico e la soluzione a bagnomaria per 30 minuti a 121 °C. Dopo l’autoclave, raffreddare la soluzione in una cella frigorifera mescolando utilizzando l’agitatore magnetico per evitare la separazione in diverse fasi. Aliquot se necessario, e conservare a 4 °C. Preparare il buffer di formulazione. Mescolare 500 mL di DPBS con 50 μL di 10% Pluronic F-68. Filtrare sterile attraverso un’unità filtrante a membrana PES da 0,2 μm e conservare a temperatura ambiente (RT). Coltura cellulare, trasfezione e trasduzione per la produzione di rAAV6Scongelare, coltivare e congelare le cellule 293AAV come descritto dal produttore utilizzando il terreno di coltura 293AAV sopra riportato e Trypsin-EDTA per la scissione. Si raccomanda di congelare alcuni passaggi precoci e utilizzare le cellule per la produzione di AAV prima che raggiungano il passaggio 40. Per la produzione di rAAV6, seminare quattro piatti di coltura cellulare da 15 cm con 5 x 106 cellule in 30 ml ciascuno. Le cellule sono pronte per la trasfezione di solito 1-2 giorni dopo la semina quando raggiungono l’80% -90% di confluenza. Scongelare un Maxiprep di plasmide pAAV contenente l’HDRT da confezionare in AAV6. Risospendere 85,6 μg del plasmide pAAV in 3 ml di terreno DMEM puro. Sciogliere 342 μL di soluzione PEI da 1 mg/mL in 3 mL di mezzo DMEM puro. Incubare entrambe le soluzioni per 10 minuti a RT. Mescolare entrambi i tubi da 3 ml in un tubo di ~ 6,4 ml di miscela di trasfezione e incubare per 20 minuti a RT. Nel frattempo, scongelare il vettore helper autosilenziante abilitato alla tetraciclina RepCap6 dal congelatore a -80 °C in un bagno d’acqua a 37 °C. Per trasdurre le cellule 293AAV, aggiungere il vettore helper ad una molteplicità di infezione (MOI) di 25 utilizzando la dose infettiva mediana di coltura tissutale (TCID 50) e assumendo 1,15 x10 7 cellule/piatto; tipicamente, vengono utilizzati 2-10 μL per piatto di 15 cm. Oscillare e far roteare delicatamente i piatti per distribuire. Dopo l’incubazione della miscela di trasfezione, aggiungerne 1,6 ml a goccia su ciascuno dei quattro piatti da 15 cm. Incubare a 37 °C e 5% di CO2 durante la notte.NOTA: In alternativa, se i vettori rAAV6 di interesse sono già disponibili, questi vettori possono essere utilizzati per fornire il genoma virale da impacchettare, il che annulla la necessità di plasmidi con questo sistema e produce titoli rAAV6 comparabili. Per questo approccio, le cellule 293AAV sono co-trasdotte con il desiderato rAAV6 ad un MOI di 50 (basato su copie del genoma rAAV6 [GC]/mL) insieme al vettore helper. Il giorno successivo, aspirare e scartare con cura il terreno di coltura e sostituirlo con 30 ml di terreno di produzione preriscaldato. Incubare per altre 96 ore prima della raccolta. Non si raccomanda alcun ulteriore cambiamento del mezzo per massimizzare i rendimenti. Raccolta e purificazione dell’AAV6 ricombinante dal substratoSenza rimuovere le cellule dal piatto, raccogliere tutto il surnatante cellulare in un’unità filtrante con una membrana PES di 0,2 μm superiore di almeno il 50% al volume di terreno da filtrare. Quindi, filtrare il surnatante.NOTA: Se si desidera una maggiore resa di rAAV6, le cellule possono essere raccolte e l’rAAV estratto dal pellet cellulare utilizzando kit commerciali o protocolli stabiliti34,35. Poiché AAV6 è per lo più secreto nel mezzo36, è stato utilizzato solo il surnatante che riduce il lavoro, i costi e il tempo. Aggiungere 5x soluzione PEG/NaCl al surnatante filtrato al 25% del volume raccolto; questo è tipicamente 30 ml se vengono utilizzati quattro piatti da 15 cm da 30 ml. Mescolare bene invertendo e quindi incubare per una notte a 4 ° C per precipitare le particelle virali.NOTA: le particelle AAV sono stabili fino a 2 giorni in questa soluzione. Preraffreddare una centrifuga a secchio oscillante con 250 ml di inserti per tubi a 4 °C. Preparare un’unità filtrante centrifuga da 4 mL con un cutoff di 100 kDa e un filtro a siringa in PES idrofilo da 0,22 μm pretrattando ogni membrana con 2 mL di F-68 ploronico al 10% per almeno 1 ora a RT. Trasferire la miscela AAV-PEG/NaCl in una provetta da 250 ml, centrifugare a 2.500 x g per 1 ora a 4 °C, quindi rimuovere accuratamente l’intero surnatante mediante aspirazione. Risospendere il pellet virale da beige a bianco vorticando in 4 ml di HEPES 1 M fino a completa risospensione. Se necessario, lasciare riposare per 5 minuti e vortice di nuovo. Risospendere utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL e trasferire il volume totale in una provetta da 15 ml. In una cappa aspirante, aggiungere un volume uguale di cloroformio alla sospensione del virus, in genere 4 ml. Vortice vigoroso per 2 minuti, quindi centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a RT. Raccogliere lo strato superiore (supernatante contenente AAV) in un nuovo tubo da 50 ml ed eliminare lo strato inferiore (cloroformio).ATTENZIONE: Le soluzioni contenenti cloroformio sono rifiuti pericolosi. Seguire le linee guida istituzionali per il suo smaltimento. Posizionare il surnatante contenente AAV sotto una cappa aspirante e lasciare evaporare il cloroformio rimanente per 30 minuti. Nel frattempo, lavare l’unità filtrante centrifuga pretrattata e il filtro a siringa. Aggiungere 1,5 mL di tampone di formulazione all’unità filtrante centrifuga pretrattata. Centrifugare a 3.500 x g per 10 minuti a 15 °C in un rotore a benna oscillante. Ripetere questo passaggio con 4 ml di tampone di formulazione per lavare la membrana. Risciacquare il filtro della siringa due volte con 5 mL di tampone di formulazione utilizzando una siringa da 5 ml. Caricare ~4 mL di surnatante contenente AAV dall’estrazione del cloroformio in una siringa da 5 ml, collegare il filtro della siringa lavata e filtrare direttamente nell’unità filtrante centrifuga. Centrifugare a 3.500 x g per 25 minuti a 15 °C, quindi confermare che la soluzione AAV nel filtro è compresa tra 50-100 μL. Se il volume della soluzione è >100 μL, continuare a centrifugare. Dopo aver rimosso il filtrato, aggiungere 4 mL di tampone di formulazione all’interno della tazza dell’unità filtrante centrifuga e miscelare uniformemente la soluzione mediante pipettaggio. Centrifugare a 3.500 x g per 25 minuti a 15 °C, quindi confermare che la soluzione AAV nel filtro è compresa tra 50-100 μL. Se il volume della soluzione è >100 μL, continuare a centrifugare. Ripetere questo passaggio per un altro lavaggio. Dopo la centrifugazione finale, confermare che il volume della soluzione è 50-70 μL; In caso contrario, continuare a centrifugare. Trasferire il preparato in una provetta da 1,5 ml. Aliquot se lo si desidera, e conservare a -80 °C. Determinazione del titolo AAV6 ricombinante mediante qPCRNOTA: I primer qPCR ricottura nella regione ITR e dovrebbero, quindi, essere adatti a tutti i costrutti clonati in pAAV.Scongelare un’aliquota del vaa6 da titolare e un’aliquota del materiale di riferimento AAV6. Il materiale di riferimento AAV6 deve essere vicino a 4 x 1011 GC/ml; In caso contrario, regolare le diluizioni di conseguenza. Eseguire un digesto DNasi I per rimuovere qualsiasi DNA plasmidico libero residuo nella preparazione di rAAV6 combinando 2,0 μL del campione o del materiale di riferimento AAV6 con 15,6 μL di H 2 O privo di nucleasi,2,0μL di tampone 10x DNasi I e 0,4 μL di DNasi I. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a 37 °C, quindi trasferire sul ghiaccio. Si tratta della diluizione 1 (cfr. tabella 3). Preparare con acqua diluizioni seriali quintuplicate di tutti i campioni e del materiale di riferimento AAV6 come indicato nella tabella 3 . Preparare un master mix SYBR Green qPCR. Per pozzetto, miscelare 4,7 μL di acqua priva di nucleasi con 10 μL di master mix SYBR Green, 0,15 μL di primer ITR in avanti a 100 μM e 0,15 μL di primer ITR reverse a 100 μM.NOTA: Ogni campione viene misurato in duplicato, con 16 pozzetti per lo standard di riferimento, 8 pozzi per campione e 2 pozzetti per un controllo senza modello. Preparare il 10% in più di master mix per tenere conto dell’errore di pipettaggio. In una piastra di reazione ottica a 96 pozzetti o 384 pozzetti, caricare 15 μL/pozzetto della miscela master qPCR SYBR Green. Quindi, caricare 5 μL di campioni e materiale di riferimento AAV6 o acqua priva di nucleasi per il controllo senza modello. Per lo standard di riferimento AAV6, diluizione del carico da 2 a diluizione 9. Per i campioni, caricare la diluizione da 5 a 8. Misurare ogni diluizione in duplice copia. Evita le bolle. Sigillare la piastra caricata con pellicola ottica trasparente, centrifugare a 800 x g per 1 minuto a RT e caricare la piastra nello strumento qPCR con la configurazione appropriata a 96 pozzetti o 384 pozzetti. Impostare ed eseguire lo strumento qPCR utilizzando il rilevamento SYBR con le seguenti condizioni di ciclo: 98 °C per 3 minuti, poi 40 cicli di 98 °C per 15 s e 58 °C per 30 s, seguiti da una curva di fusione. Analizzare i dati con il software dello strumento utilizzando la concentrazione del materiale di riferimento AAV6 in copie del genoma per millimetro (GC/mL) come curva standard (vedere Tabella 3). Calcolare la concentrazione finale del campione moltiplicando per il fattore di diluizione. Assicurarsi che la curva standard R2 sia vicina a 1,0, che l’efficienza della PCR sia del 90%-110%, che la linea di base sia stata rimossa, che la curva di fusione mostri un singolo picco, che i valori di C t cambino in base alle diluizioni e che i duplicati siano entro 0,5 Ct; In caso contrario, escludere i valori anomali. Aspettatevi rendimenti come nella Figura 2. 2. Preparazione dei mezzi e degli stimoli delle cellule B Preparare il mezzo di scongelamento: combinare RPMI-1640 con FCS al 20%. Filtro sterile attraverso un’unità filtrante a membrana PES da 0,2 μm. Conservare a 4 °C. Preparare il terreno di coltura delle cellule B: combinare i reagenti nella Tabella 4 e quindi filtrare sterile attraverso un’unità filtrante a membrana PES da 0,2 μm. Conservare a 4 °C. Risospendere ciascuno degli stimolanti delle cellule B nella Tabella 5 alle concentrazioni di stock nel terreno di coltura di cellule B, ad eccezione di CpG ODN che deve essere risospeso in acqua priva di nucleasi. Conservare a -80 °C. Se si esegue deplezione negativa delle cellule non B (fase 4 facoltativa), preparare DPBS (senza calcio, senza magnesio) con FCS al 2% (DPBS al 2% FCS). Filtro sterile attraverso un’unità filtrante a membrana PES da 0,2 μm. Conservare a 4 °C. 3. Preparazione e coltura di cellule B di macaco rhesus NOTA: Le PBMC o gli splenociti del macaco rhesus crioconservati vengono utilizzati per impostare la coltura cellulare30,31. Terreno di scongelamento precaldo e terreno di coltura a cellule B in bagnomaria a 37 °C. Scongelare gli stimolanti delle cellule B dalla Tabella 5 sul ghiaccio. Preparare un tubo di dimensioni appropriate contenente un mezzo di scongelamento preriscaldato. Questo dovrebbe idealmente essere più di 10 volte il volume delle cellule scongelate. Scongelare uno o due crioviali di PBMC o splenociti alla volta in bagnomaria a 37 °C e decantare nel tubo preparato con mezzo preriscaldato. Risciacquare i criotubi per raccogliere tutte le cellule. Centrifugare le cellule a 200 x g per 10 minuti a RT.NOTA: Queste impostazioni di centrifugazione riducono la contaminazione piastrinica preservando le rese di PBMC. È possibile utilizzare velocità più elevate, ad esempio 350 x g per 5 minuti. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno di scongelamento per il lavaggio. Ripetere il punto 3.4 e il passaggio 3.5 per un totale di tre centrifugazioni per rimuovere il mezzo di congelamento. Dopo l’ultima centrifugazione, risospendere le cellule a una stima di ~ 5 x 106 cellule / ml in mezzo di coltura cellulare B.NOTA: Il protocollo di cui sopra coltiva PBMC intere o preparati di splenociti con contaminazione da altre cellule. Se sono necessarie colture di cellule B più pure, anche se con rese totali di cellule B significativamente ridotte, continuare con la fase 4. Non sono state osservate differenze nell’efficienza di editing tra i due metodi. Diluire un’aliquota di 10 μL di cellule secondo necessità con terreno di coltura di cellule B per il conteggio. Contare utilizzando un emocitometro e la colorazione blu tripano, combinando volumi uguali di cellule risospese e soluzione di tripano blu allo 0,4%. Regolare la concentrazione cellulare a 3 x 106 cellule / ml con terreno di coltura di cellule B in base alla conta cellulare. Quindi, aggiungere gli stimolanti delle cellule B alle loro concentrazioni finali secondo la Tabella 5 e mescolare. Trasferire le cellule in un piatto di coltura cellulare appropriato. Nel complesso, si raccomanda 0,6 x 10 6-0,7 x 106 celle / cm2. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO 2 per 48 ore ±2 ore. 4. Deplezione negativa facoltativa delle cellule non-B NOTA: La resa e la purezza dipendono dalla percentuale di input delle cellule B tra le PBMC, che può differire drasticamente tra i singoli macachi rhesus27. Aspettatevi purezza dell’80%-95%, efficienza del 60% e 1 x 10 6-1,5 x 106 celle da 1 x 107 PBMC. Dopo l’ultimo lavaggio (fase 3.6), risospendere le cellule a 1 x 108 cellule/ml in DPBS 2% FCS e blocco Fc-umano diluito 1:200. Il conteggio delle cellule si basa sul numero di cellule scongelate. Incubare per 15 minuti su ghiaccio per bloccare i recettori Fc e quindi aggiungere gli anticorpi biotinilati nella Tabella 6. Incubare per altri 20 minuti sul ghiaccio. Rabbboccare il tubo con DPBS 2% FCS e centrifugare a 200 x g per 10 minuti a 4 °C. Risospendere le celle in DPBS 2% FCS all’80% del volume dal punto 4.1 (cioè 80 μL per 1 x 107 celle). Aggiungere sfere magnetiche di streptavidina alla sospensione cellulare al 20% del volume dal punto 4.1 (cioè 20 μL di perline per 1 x 107 celle). Incubare le cellule per 15 minuti sul ghiaccio e agitare di tanto in tanto. Nel frattempo, per 1 x 108 celle, preparare un separatore magnetico con una grande colonna di esaurimento magnetico e un filtro di pre-separazione. Risciacquare il filtro e la colonna di pre-separazione con 2 ml di DPBS 2% FCS per gravità e scartare il flusso passante. Installare una provetta di raccolta da 15 ml.NOTA: L’uso di altre colonne come colonne di selezione positiva o altri sistemi di purificazione magnetica delle perline può ridurre drasticamente la purezza. Dopo l’incubazione, rabboccare le cellule a 0,5 ml con DPBS 2% FCS se il volume è <0,5 mL. Se il volume è ≥0,5 ml, è sufficiente procedere. Caricare la sospensione della cella nel filtro di pre-separazione sulla colonna preparata e raccogliere il flusso nel tubo da 15 ml. Eluire due volte le cellule B arricchite non legate aggiungendo 1 mL di DPBS 2% FCS nel filtro di pre-separazione. Raccogliere le celle non legate nello stesso tubo per flusso di gravità.NOTA: Un’ulteriore eluizione può aumentare marginalmente la resa. La purezza e l’efficienza possono essere valutate dalla citometria a flusso delle cellule di input, delle cellule arricchite e delle cellule trattenute sulla colonna. Per ottenere le celle trattenute sulla colonna, rimuovere la colonna dal magnete e sciacquare con 3 mL di DPBS 2% FCS utilizzando lo stantuffo fornito. Se lo si desidera, valutare la purezza mediante citometria a flusso come indicato nella Figura 3 utilizzando i reagenti nella Tabella 7. Centrifugare le cellule B arricchite a 200 x g per 10 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule a una stima di ~ 5 x 106 cellule / ml in terreno di coltura cellulare B e continuare al punto 3.7. 5. Editing genetico primario delle cellule B del macaco rhesus Dopo aver attivato le cellule B del macaco rhesus per 48 ore ± 2 ore, preparare i reagenti per l’elettroporazione e la trasduzione.DMSO preriscaldato, tampone duplex privo di nucleasi, buffer T e buffer E (kit di elettroporazione da 10 μL) o E2 (kit di elettroporazione da 100 μL) dal kit di elettroporazione a RT. Scongelare gli stimolanti delle cellule rAAV6 HDRT e B dalla Tabella 5 sul ghiaccio. Risospendere gli sgRNA di CRISPR-Cas9 a 100 μM in tampone duplex. Ricostituire per 10 minuti a RT e mescolare vorticando e sfarfallando. Mantenere gli sgRNA ricostituiti su ghiaccio fino all’uso. Conservare a -80 °C.NOTA: Gli sgRNA CRISPR-Cas9 possono essere progettati con vari strumenti online (vedi 1.1.1) e possono variare drasticamente nella loro efficienza di taglio. Si consiglia di testare empiricamente l’efficienza di taglio utilizzando saggi come TIDE37 o ICE38. Per elettroporazione da 10 μL, preparare 550 μL di terreno di coltura di cellule B con tutti gli stimolanti della Tabella 5 e aggiungere l’1% di DMSO. Scala i volumi di 10 volte per elettroporazioni da 100 μL. Opzionalmente, il 10% di questo mezzo può essere preparato senza antibiotico-antimicotico, che aumenta leggermente la vitalità cellulare dopo la trasfezione. Per elettroporazione da 10 μL, preparare un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 48 pozzetti con 50 μL di terreno di coltura cellulare B con stimolanti e senza antibiotico-antimicotico, se lo si utilizza. Per elettroporazioni da 100 μL, pipettare 500 μL nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Aggiungi rAAV6 HDRT al mezzo nei pozzetti, fino al 20% del volume nel pozzo. Puntare a MOI che vanno da 1 x 10 5-1 x 10 6 in base al numero di cellule per trasfezione (elettroporazione 10 μL: 5 x 10 5 cellule; 100 μL elettroporazione:5 x 106 cellule) e il GC nella preparazione rAAV6. Si raccomandano elevate concentrazioni di stock di rAAV6 da 5 x 1013 GC/ml a 5 x 1014 GC/ml per ottenere MOI elevati con volumi ridotti.NOTA: MOI inferiori possono portare a una riduzione dell’efficienza di editing e MOI di 5 x 105 sono generalmente vicini alle massime efficienze di editing che abbiamo visto. Non è stata osservata un’influenza di MOI variabili sulla vitalità delle cellule B. Si consiglia di includere controlli senza rAAV6 HDRT, senza trasfezione RNP e senza entrambi. Preriscaldare i piatti preparati e il terreno rimanente trasferendoli in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2. Per elettroporazione da 10 μL, preparare 1,15 μL di ribonucleoproteina (RNP): mescolare 0,4 μL di 61 μM Cas9 con 0,75 μL di 100 μM di sgRNA in tampone duplex. Preparare extra (si consiglia il 30% in più per una singola elettroporazione) a causa di errori di pipettaggio e per evitare bolle durante il caricamento delle punte di elettroporazione. Scala 10 volte per punte da 100 μL. Incubare l’RNP per almeno 15 minuti a RT prima di mescolare con le cellule. Dopo l’incubazione, più RNP possono essere combinati se più di un locus deve essere preso di mira contemporaneamente. Non sono state osservate differenze significative nell’efficienza con un massimo di tre loci contemporaneamente. Nel frattempo, preparare le cellule per l’elettroporazione. Mantenere le celle a RT in ogni momento per evitare shock termici. Raccogliere le cellule dopo 48 ore ± 2 ore di coltura in un recipiente appropriato. Risciacquare i piatti con DPBS per raccogliere il numero massimo di celle. Centrifugare le cellule a 200 x g per 10 minuti a RT. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in DPBS a ~ 2 x 106 cellule / ml. Combinare 10 μL di soluzione di tripano blu allo 0,4% con 10 μL della sospensione cellulare e contare utilizzando un emocitometro.NOTA: A questo punto, a causa della perdita durante la raccolta e il lavaggio, aspettatevi circa il 60% delle cellule che sono state messe in coltura 48 h ± 2h prima. Nel frattempo, centrifugare le cellule a 200 x g per 10 minuti a RT. Scartare il surnatante, assicurandosi di ridurre al minimo eventuali DPBS rimanenti. Risospendere le cellule nel tampone T preriscaldato (RT) a 5,55 x 107 cellule/ml in base al conteggio delle cellule di cui sopra. Impostare il sistema di trasfezione accendendo la macchina e impostandola su 1.350 V, 15 ms e 1 impulso. Posizionare la stazione della pipetta all’interno della cappa a flusso laminare Per ogni set di 10 elettroporazioni, preparare un tubo di trasfezione con 3 ml di tampone E (per trasfezioni da 10 μL) o E2 (per trasfezioni da 100 μL). Inserire il tubo nella stazione delle pipette. Per elettroporazione da 10 μL, combinare 1,15 μL di RNP con 9 μL di cellule. Assicurarsi di avere un volume sufficiente (+30%) per evitare di aspirare aria nella punta dell’elettroporazione. Incubare a RT per 1-2 minuti prima dell’elettroporazione. Aspirare 10 μL o 100 μL di RNP e miscela cellulare nella punta di elettroporazione di dimensioni appropriate su una pipetta per elettroporazione, inserire la pipetta caricata nella stazione della pipetta e avviare l’elettroporazione. Assicurati che le punte siano completamente prive di bolle d’aria per evitare l’arco. Osservare durante l’elettroporazione per verificare che non si verifichi un arco elettrico. Espellere immediatamente le cellule elettroporate nel piccolo volume di mezzo preparato, preriscaldato, con o senza rAAV6 all’interno della piastra da 48 pozzetti (trasfezioni da 10 μL) o 6 pozzetti (trasfezioni da 100 μL). Ripetere i passaggi 5.15-5.17 con i campioni rimanenti. Aggiungi campioni di controllo senza trasfezione ai pozzetti di coltura. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO 2 per 4 ore ±2 ore, quindi aggiungere il terreno di coltura cellulare B preparato e preriscaldato contenente stimolanti, DMSO e antibiotici/antimicotici: 450 μL per trasfezioni da 10 μL o 4,5 ml per trasfezioni da 100 μL. Continuare l’incubazione a 37 °C con 5% di CO2 per 12-24 ore. Quindi, cambiare il terreno in terreno di coltura di cellule B contenente stimolanti e antibiotici / antimicotici senza DMSO se si desidera una coltura estesa. L’analisi del DNA genomico può essere effettuata dopo 24 ore. La PCR digitale a goccia utilizzando un primer all’esterno del braccio di omologia e un primer all’interno dell’inserto può essere utilizzato per quantificare l’efficienza di editing39. Eseguire PCR per amplificare il sito di inserimento e sequenziamento Sanger per verificare la corretta modifica. Per l’analisi dei livelli proteici, coltivare le cellule per 40-48 ore dopo l’elettroporazione per consentire cambiamenti di espressione proteica ed eseguire un’analisi mediante citometria a flusso utilizzando i reagenti nella Tabella 7.