Genbewerking van primaire resusapen B-cellen

Alle dierprocedures en experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. Een samenvatting van de volgende protocollen is weergegeven in figuur 1. Mannelijke en vrouwelijke resusapen (Macaca mulatta) van Indiase genetische oorsprong in de leeftijd van 2-8 jaar oud werden gehuisvest en verzorgd in overeenstemming met de richtlijnen van het Comité voor de verzorging en het gebruik van proefdieren in een bioveiligheidsniveau 2-faciliteit. LET OP: Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de universele voorzorgsmaatregelen voor door bloed overgedragen pathogenen, met steriele / aseptische technieken en de juiste bioveiligheidsniveau 2-apparatuur in laminaire stroomkappen. 1. rAAV6 productie Bereid de reagentia voor op rAAV6-productie.Ontwerp en kloon de homologie-gerichte reparatiesjabloon tussen de inverted terminal repeats (ITR’s) van AAV2 in de vector pAAV met behulp van standaardtechnieken. Zorg ervoor dat de homologiearmen aan weerszijden ten minste ~ 250 bp zijn, maar zo weinig als 60 bp kan voldoende zijn, hoewel langere homologiearmen de voorkeur hebben als het constructieontwerp dit toelaat. Als doelsequenties van een van de gebruikte sgRNA’s aanwezig zijn in de HDRT, verwijder ze dan met behulp van stille mutaties, die het meest effectief zijn in het protospacer aangrenzende motief of zaadgebied van de doellocatie.OPMERKING: Gensynthese in combinatie met Gibson-assemblage voor efficiënt klonen32 kan worden uitgevoerd. Bereid een Maxiprep van een juiste kloon voor transfectie. Voor sgRNA-ontwerp wordt CHOPCHOP33 aanbevolen en een lijst met meer tools is te vinden op https://zlab.bio/guide-design-resources. De maximale verpakkingscapaciteit voor AAV inclusief ITR’s is ~4,7 kb. AAV6 is het meest gebruikte serotype voor het bewerken van hematopoëtische cellen, met name B-cellen9. Andere serotypen van AAV voor de genbewerking van resusapen B-cellen zijn niet getest, maar AAV28 en AAV-DJ10,11 zijn gebruikt in muisstudies. Bereid 293AAV-kweekmedium en productiemedium volgens tabel 1 en tabel 2. Steriele filter door een 0,2 μm polyethersulfon (PES) membraanfiltereenheid. Bewaren bij 4 °C. Bereid 1x polyethylenimine (PEI) oplossing (1 mg/ml, 100 ml). Verwarm in een glazen bekerglas van 250 ml ~ 70 ml H2O in een magnetron gedurende ~ 30 s en voeg vervolgens 100 mg PEI toe. Voeg een magneetroerder toe en roer tot de PEI grotendeels is opgelost. Stel de pH in op 7 met 1 M HCl, vul vervolgens aan tot 100 ml met H2O, wacht 10 minuten, controleer de pH opnieuw en pas indien nodig aan. Steriel filtreer de PEI-oplossing door een 0,2 μm PES-membraanfiltereenheid, aliquot en bewaar −20 °C. Na het ontdooien kan de oplossing maximaal 2 maanden bij 4 °C worden bewaard. Bereid 5x polyethyleenglycol (PEG)/NaCl-oplossing. Weeg 400 g PEG 8.000 en 24 g NaCl af. Voeg een magneetroerder toe aan een glazen bekerglas van 2 L, voeg de gewogen PEG 8.000 en NaCl toe en spoel af met ~ 550 ml gedeïoniseerd water. Roer met verhitting en breng aan de kook of 80-90 °C tot het volledig is opgelost. Stel de pH in op ~ 7,4 met 1 M NaOH, stel vervolgens het volume in op 1 L met behulp van een maatcilinder en breng het over in een glazen fles van 2 L met de magnetische roerder. Autoclaaf de fles, magneetroerder en oplossing in een waterbad gedurende 30 minuten bij 121 °C. Na het autoclaveren koelt u de oplossing in een koude ruimte terwijl u roert met behulp van de magneetroerder om scheiding in verschillende fasen te voorkomen. Aliquot indien nodig, en bewaren bij 4 °C. Bereid de formuleringsbuffer voor. Meng 500 ml DPBS met 50 μL 10% Pluronic F-68. Steriele filter door een 0,2 μm PES membraanfiltereenheid en bewaren bij kamertemperatuur (RT). Celkweek, transfectie en transductie voor rAAV6-productieOntdooi, kweek en bevries 293AAV-cellen zoals beschreven door de fabrikant met behulp van het bovenstaande 293AAV-kweekmedium en Trypsine-EDTA voor het splitsen. Het wordt aanbevolen om enkele vroege passages te bevriezen en de cellen te gebruiken voor AAV-productie voordat ze passage 40 bereiken. Voor rAAV6-productie, zaai vier celkweekschalen van 15 cm met 5 x 106 cellen in elk 30 ml. De cellen zijn klaar voor transfectie meestal 1-2 dagen na het zaaien wanneer ze 80% -90% samenvloeiing bereiken. Ontdooi een Maxiprep van pAAV-plasmide met daarin de HDRT die in AAV6 moet worden verpakt. Resuspendie 85,6 μg van het pAAV-plasmide in 3 ml zuiver DMEM-medium. Los 342 μL 1 mg/ml PEI-oplossing op in 3 ml zuiver DMEM-medium. Incubeer beide oplossingen gedurende 10 minuten bij RT. Meng beide buizen van 3 ml in één buis van ~ 6,4 ml transfectiemengsel en incubeer gedurende 20 minuten bij RT. Ontdooi ondertussen de tetracycline-enabled, zelf-dempende helpervector RepCap6 uit de vriezer van −80 °C in een waterbad van 37 °C. Om de 293AAV-cellen te transduceren, voegt u de helpervector toe bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 25 met behulp van de mediane infectieuze dosis weefselkweek (TCID 50) en uitgaande van 1,15 x10 7 cellen / schotel; meestal wordt 2-10 μL gebruikt per schaal van 15 cm. Rock en draai de gerechten zachtjes om te verdelen. Voeg na de incubatie van het transfectiemengsel 1,6 ml druppelsgewijs toe aan elk van de vier schotels van 15 cm. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende een nacht.OPMERKING: Als alternatief, als de rAAV6-vectoren van belang al beschikbaar zijn, kunnen deze vectoren worden gebruikt om het virale genoom te verpakken te leveren, wat de noodzaak voor plasmiden met dit systeem tenietdoet en vergelijkbare rAAV6-titers oplevert. Voor deze benadering worden de 293AAV-cellen samen met de gewenste rAAV6 getransduceerd bij een MOI van 50 (gebaseerd op rAAV6-genoomkopieën [GC] / ml) samen met de helpervector. Zuig de volgende dag het kweekmedium voorzichtig op en gooi het weg en vervang het door 30 ml voorverwarmd productiemedium. Incubeer nog eens 96 uur voor het oogsten. Er wordt geen verdere mediumverandering aanbevolen om de opbrengsten te maximaliseren. Oogst en zuivering van de recombinant AAV6 uit het mediumZonder cellen uit de schaal te verwijderen, verzamelt u al het celsupernatant in een filtereenheid met een PES-membraan van 0,2 μm dat ten minste 50% groter is dan het volume van het te filteren medium. Filter vervolgens het supernatant.OPMERKING: Als hogere opbrengsten van rAAV6 gewenst zijn, kunnen de cellen worden geoogst en de rAAV uit de celpellet worden geëxtraheerd met behulp van commerciële kits of vastgestelde protocollen34,35. Omdat AAV6 meestal wordt uitgescheiden in het medium36, werd alleen supernatant gebruikt, waardoor arbeid, kosten en tijd werden verminderd. Voeg 5x PEG/NaCl-oplossing toe aan het gefilterde supernatant op 25% van het verzamelde volume; dit is meestal 30 ml als vier schaaltjes van 15 cm van 30 ml worden gebruikt. Meng goed door om te keren en incubeer vervolgens een nacht bij 4 °C om de virale deeltjes neer te slaan.OPMERKING: AAV-deeltjes zijn stabiel gedurende maximaal 2 dagen in deze oplossing. Voorkoel een draaiemmercentrifuge met 250 ml buisinzetstukken voor tot 4 °C. Bereid een centrifugaalfiltereenheid van 4 ml met een afsnijding van 100 kDa en een hydrofiele PES-spuitfilter van 0,22 μm voor door elk membraan voor te behandelen met 2 ml 10% Pluronic F-68 gedurende ten minste 1 uur bij RT. Breng het AAV-PEG/NaCl-mengsel over in een buis van 250 ml, centrifugeer gedurende 1 uur bij 4 °C bij 2.500 x g en verwijder vervolgens voorzichtig het hele supernatant door aspiratie. Resuspendeer de beige tot witte virale pellet door vortexing in 4 ml van 1 M HEPES totdat deze volledig is geresuspendeerd. Laat het desnoods 5 min staan, en vortex opnieuw. Resuspendeer met behulp van een serologische pipet van 5 ml en breng het totale volume over in een buis van 15 ml. Voeg in een zuurkast een gelijk volume chloroform toe aan de virussuspensie – meestal 4 ml. Krachtig vortex gedurende 2 minuten, en dan centrifugeren op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verzamel de bovenste laag (AAV-bevattend supernatant) in een nieuwe buis van 50 ml en gooi de onderste laag (chloroform) weg.LET OP: Chloroform-bevattende oplossingen zijn gevaarlijk afval. Volg de institutionele richtlijnen voor de verwijdering ervan. Plaats het AAV-bevattende supernatant onder een zuurkast en laat het resterende chloroform gedurende 30 minuten verdampen. Was ondertussen de voorbehandelde centrifugaalfiltereenheid en het spuitfilter. Voeg 1,5 ml formuleringsbuffer toe aan de voorbehandelde centrifugaalfiltereenheid. Centrifugeer bij 3.500 x g gedurende 10 minuten bij 15 °C in een draaibakrotor. Herhaal deze stap met 4 ml formuleringsbuffer om het membraan te wassen. Spoel het spuitfilter tweemaal met 5 ml formuleringsbuffer met een spuit van 5 ml. Laad het ~4 ml AAV-bevattende supernatant uit de chloroformextractie in een spuit van 5 ml, bevestig het gewassen spuitfilter en filtreer rechtstreeks in de centrifugaalfiltereenheid. Centrifugeer gedurende 25 minuten bij 15 °C bij 3.500 x g en bevestig vervolgens dat de AAV-oplossing in het filter ongeveer tussen 50-100 μl ligt. Als het volume van de oplossing >100 μl is, blijft u centrifugeren. Voeg na het verwijderen van het filtraat 4 ml formuleringsbuffer toe in de kop van de centrifugaalfiltereenheid en meng de oplossing gelijkmatig door pipetteren. Centrifugeer gedurende 25 minuten bij 3.500 x g bij 15 °C en bevestig vervolgens dat de AAV-oplossing in het filter tussen 50-100 μl ligt. Als het volume van de oplossing >100 μl is, blijft u centrifugeren. Herhaal deze stap voor een nieuwe wasbeurt. Controleer na de laatste centrifugatie of het volume van de oplossing 50-70 μL is; Zo niet, ga dan door met centrifugeren. Breng het preparaat over in een tube van 1,5 ml. Aliquot indien gewenst, en bewaren bij −80 °C. Recombinante AAV6-titerbepaling met qPCROPMERKING: De qPCR-primers gloeien in het ITR-gebied en moeten dus geschikt zijn voor alle constructies die in pAAV zijn gekloond.Ontdooi een aliquot van de te titeren rAAV6 en een aliquot van het AAV6-referentiemateriaal. Het AAV6-referentiemateriaal moet dicht bij 4 x 1011 GC / ml liggen; Pas anders de verdunningen dienovereenkomstig aan. Voer een DNase I-vertering uit om het resterende vrije plasmide-DNA in het rAAV6-preparaat te verwijderen door 2,0 μL van het monster of AAV6-referentiemateriaal te combineren met 15,6 μL nucleasevrij H 2 O,2,0μL 10x DNase I-buffer en 0,4 μL DNase I. Meng en incubeer zachtjes gedurende 30 minuten bij 37 °C en breng het vervolgens over op ijs. Dit is verdunning 1 (zie tabel 3). Bereid vijfvoudige seriële verdunningen van alle monsters en het AAV6-referentiemateriaal zoals in tabel 3 hieronder met water. Bereid een SYBR Green qPCR master mix. Meng per put 4,7 μL nucleasevrij water met 10 μL SYBR Green master mix, 0,15 μL ITR primer forward bij 100 μM en 0,15 μL ITR primer reverse bij 100 μM.OPMERKING: Elk monster wordt in tweevoud gemeten, met 16 putten voor de referentiestandaard, 8 putten per monster en 2 putten voor een controle zonder sjabloon. Bereid 10% meer mastermix voor om rekening te houden met pipetteerfouten. Laad in een optische 96-well of 384-well reactieplaat 15 μL/well van de SYBR Green qPCR master mix. Laad vervolgens 5 μL monsters en AAV6-referentiemateriaal of nucleasevrij water voor de controle zonder sjabloon. Voor de AAV6-referentienorm, belastingsverdunning 2 tot verdunning 9. Voor monsters, belastingsverdunning 5 tot verdunning 8. Meet elke verdunning in tweevoud. Vermijd bubbels. Sluit de geladen plaat af met optische transparante film, centrifugeer op 800 x g gedurende 1 minuut bij RT en laad de plaat in het qPCR-instrument met de juiste 96-well of 384-well setup. Stel het qPCR-instrument in en voer het uit met behulp van SYBR-detectie met de volgende cyclusomstandigheden: 98 °C gedurende 3 minuten, vervolgens 40 cycli van 98 °C gedurende 15 s en 58 °C gedurende 30 s, gevolgd door een smeltcurve. Analyseer de gegevens met de software van het instrument met behulp van de concentratie van het AAV6-referentiemateriaal in genoomkopieën per millimeter (GC / ml) als de standaardcurve (zie tabel 3). Bereken de uiteindelijke concentratie van het monster door vermenigvuldiging met de verdunningsfactor. Zorg ervoor dat de standaardcurve R2 dicht bij 1,0 ligt, de PCR-efficiëntie 90% -110% is, de basislijn is verwijderd, de smeltcurve een enkele piek toont, de C t-waarden veranderen in overeenstemming met de verdunningen en de duplicaten binnen 0,5 Ct liggen; sluit anders uitschieters uit. Verwacht rendementen zoals in figuur 2. 2. B-cel media en stimuli voorbereiden Ontdooimedium voorbereiden: Combineer RPMI-1640 met 20% FCS. Steriel filter door een 0,2 μm PES membraanfilterunit. Bewaren bij 4 °C. B-celkweekmedium bereiden: Combineer de reagentia in tabel 4 en filter vervolgens steriel door een PES-membraanfiltereenheid van 0,2 μm. Bewaren bij 4 °C. Resuspendie van elk van de B-celstimulerende middelen in tabel 5 bij voorraadconcentraties in B-celkweekmedium, met uitzondering van CpG ODN dat moet worden geresuspendeerd in nucleasevrij water. Bewaren bij −80 °C. Als u niet-B-celnegatieve depletie uitvoert (optionele stap 4), bereidt u DPBS (geen calcium, geen magnesium) voor met 2% FCS (DPBS 2% FCS). Steriel filter door een 0,2 μm PES membraanfilterunit. Bewaren bij 4 °C. 3. Bereiding en kweek van resusapen B-cellen OPMERKING: Gecryopreserveerde resusapen PBMC’s of splenocyten worden gebruikt om de celcultuur30,31 op te zetten. Voorwarm ontdooimedium en B-celkweekmedia in een waterbad van 37 °C. Ontdooi de B-cel stimulerende middelen uit tabel 5 op ijs. Bereid een buis van de juiste grootte met voorverwarmd ontdooimedium. Dit zou idealiter meer dan 10-voudig het volume van de ontdooide cellen moeten zijn. Ontdooi één tot twee cryovialen van PBMC’s of splenocyten tegelijk in een waterbad van 37 °C en decanteer in de bereide buis met voorverwarmd medium. Spoel de cryobuizen om alle cellen te verzamelen. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 10 minuten bij RT.OPMERKING: Deze centrifugatie-instellingen verminderen de bloedplaatjesverontreiniging met behoud van de PBMC-opbrengsten. Hogere snelheden zoals 350 x g gedurende 5 minuten kunnen worden gebruikt. Resuspendeer de cellen in 10 ml ontdooimedium voor het wassen. Herhaal stap 3.4 en stap 3.5 voor in totaal drie centrifugaties om het vriesmedium te verwijderen. Na de laatste centrifugatie, resuspendien de cellen met een geschatte ~ 5 x 106 cellen / ml in B-celkweekmedium.OPMERKING: Het bovenstaande protocol kweekt hele PBMC- of splenocytenpreparaten met besmetting door andere cellen. Als zuiverdere B-celculturen nodig zijn, zij het bij aanzienlijk verminderde totale B-celopbrengsten, ga dan verder met stap 4. Er zijn geen verschillen waargenomen in de bewerkingsefficiëntie tussen de twee methoden. Verdun zo nodig een hoeveelheid van 10 μL cellen met B-celkweekmedium voor het tellen. Tel met behulp van een hemocytometer en trypan blauwe kleuring, waarbij gelijke volumes geresuspendeerde cellen en trypan blue 0,4% -oplossing worden gecombineerd. Pas de celconcentratie aan op 3 x 106 cellen / ml met B-celkweekmedium volgens het celgetal. Voeg vervolgens de B-celstimulerende middelen toe aan hun uiteindelijke concentraties volgens tabel 5 en meng. Breng de cellen over in een geschikte celkweekschaal. Over het algemeen wordt 0,6 x 10 6-0,7 x 106 cellen / cm2 aanbevolen. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO 2 gedurende 48 uur ±2 uur. 4. Optionele negatieve depletie van niet-B-cellen OPMERKING: Opbrengst en zuiverheid zijn afhankelijk van het invoerpercentage van B-cellen onder de PBMC’s, dat drastisch kan verschillen tussen individuele resusapen27. Verwacht 80% -95% zuiverheid, 60% efficiëntie en 1 x 10 6-1,5 x 106 cellen van 1 x 107 PBMC’s. Na de laatste wasbeurt (stap 3.6) resuspensie van de cellen bij 1 x 108 cellen/ml in DPBS 2% FCS en humaan Fc-blok verdund 1:200. Het aantal cellen is gebaseerd op het aantal ontdooide cellen. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs om de Fc-receptoren te blokkeren en voeg vervolgens de gebiotinyleerde antilichamen in tabel 6 toe. Incubeer nog eens 20 minuten op ijs. Vul de buis aan met DPBS 2% FCS en draai gedurende 10 minuten op 200 x g bij 4 °C. Resuspendeer de cellen in DPBS 2% FCS bij 80% van het volume uit stap 4.1 (d.w.z. 80 μL per 1 x 107 cellen). Voeg magnetische streptavidin-kralen toe aan de celsuspensie op 20% van het volume uit stap 4.1 (d.w.z. 20 μL kralen per 1 x10 7 cellen). Incubeer de cellen gedurende 15 minuten op ijs en roer af en toe. Maak ondertussen per 1 x 108 cellen een magnetische separator met een grote magnetische depletiekolom en een voorscheidingsfilter. Spoel het voorscheidingsfilter en de kolom af met 2 ml DPBS 2% FCS door zwaartekrachtstroom en gooi de doorstroming weg. Installeer een opvangbuis van 15 ml.OPMERKING: Het gebruik van andere kolommen zoals positieve selectiekolommen of andere magnetische kralenzuiveringssystemen kan de zuiverheid drastisch verminderen. Na incubatie vult u de cellen aan tot 0,5 ml met DPBS 2% FCS als het volume <0,5 ml is. Als het volume ≥0,5 ml is, gaat u gewoon verder. Laad de celsuspensie in het voorscheidingsfilter op de voorbereide kolom en vang de doorstroming in de buis van 15 ml. Elueer de ongebonden verrijkte B-cellen tweemaal door 1 ml DPBS 2% FCS toe te voegen aan het voorscheidingsfilter. Verzamel de ongebonden cellen in dezelfde buis door zwaartekrachtstroom.OPMERKING: Extra elutie kan de opbrengst marginaal verhogen. De zuiverheid en efficiëntie kunnen worden geëvalueerd door de flowcytometrie van de invoercellen, verrijkte cellen en cellen die op de kolom worden bewaard. Om de cellen op de kolom te verkrijgen, verwijdert u de kolom van de magneet en spoelt u met 3 ml DPBS 2% FCS met behulp van de meegeleverde zuiger. Evalueer desgewenst de zuiverheid door middel van flowcytometrie zoals in figuur 3 met behulp van de reagentia in tabel 7. Centrifugeer de verrijkte B-cellen bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de cellen met een geschatte ~ 5 x 106 cellen / ml in B-celkweekmedium en ga verder met stap 3.7. 5. Primaire resusapen B-cel genbewerking Na het activeren van de resusapen B-cellen gedurende 48 uur ± 2 uur, bereidt u de reagentia voor op elektroporatie en transductie.Voorwarme DMSO, nucleasevrije duplexbuffer, buffer T en buffer E (10 μL elektroporatiekit) of E2 (100 μL elektroporatiekit) van de elektroporatiekit naar RT. Ontdooi de rAAV6 HDRT- en B-celstimulerende middelen uit tabel 5 op ijs. Resuspendeer de CRISPR-Cas9 sgRNA’s bij 100 μM in duplexbuffer. Reconstitueer gedurende 10 minuten bij RT en meng door vortexing en flicking. Bewaar de gereconstitueerde sgRNA’s op ijs tot gebruik. Bewaren bij −80 °C.OPMERKING: CRISPR-Cas9 sgRNA’s kunnen worden ontworpen met verschillende online tools (zie 1.1.1) en kunnen drastisch variëren in hun snij-efficiëntie. Empirisch testen van de snij-efficiëntie wordt aanbevolen met behulp van assays zoals TIDE37 of ICE38. Bereid per 10 μL elektroporatie 550 μL B-celkweekmedium met alle stimulerende middelen uit tabel 5 en voeg 1% DMSO toe. Schaal de volumes 10-voudig voor 100 μL elektroporaties. Optioneel kan 10% van dit medium worden bereid zonder antibioticum-antimycoticum, wat de levensvatbaarheid van de cel na transfectie enigszins verhoogt. Per 10 μL elektroporatie, maak een put van een 48-well celkweekplaat met 50 μL van het B-celkweekmedium met stimulerende middelen en zonder antibioticum-antimycoticum, indien gebruikt. Voor 100 μL elektroporaties, pipet 500 μL in de putjes van een 6-well plaat. Voeg rAAV6 HDRT toe aan het medium in de putten, tot 20% van het volume in de put. Streef naar MOI’s variërend van 1 x 10 5-1 x 10 6 op basis van het aantal cellen per transfectie (10 μL elektroporatie: 5 x 10 5 cellen; 100 μL elektroporatie:5 x 106 cellen) en de GC in het rAAV6-preparaat. Hoge rAAV6-voorraadconcentraties van 5 x 1013 GC/ml tot 5 x10 14 GC/ml worden aanbevolen om hoge MOI’s met lage volumes te bereiken.OPMERKING: Lagere MOI’s kunnen leiden tot verminderde bewerkingsefficiëntie en MOI’s van 5 x 105 liggen over het algemeen dicht bij de maximale bewerkingsefficiëntie die we hebben gezien. Een invloed van verschillende MOI’s op de levensvatbaarheid van B-cellen is niet waargenomen. Het wordt aanbevolen om bedieningselementen op te nemen zonder rAAV6 HDRT, zonder RNP-transfectie en zonder beide. Verwarm de bereide gerechten en het resterende medium voor door ze over te brengen in een incubator bij 37 °C met 5% CO2. Bereid per 10 μL elektroporatie 1,15 μL ribonucleoproteïne (RNP): Meng 0,4 μL 61 μM Cas9 met 0,75 μL 100 μM sgRNA in duplexbuffer. Bereid extra voor (30% meer voor een enkele elektroporatie wordt aanbevolen) vanwege pipetteerfout en om bellen te voorkomen bij het laden van de elektroporatietips. Schaal 10-voudig voor 100 μL tips. Incubeer de RNP gedurende ten minste 15 minuten bij RT voordat u zich mengt met de cellen. Na incubatie kunnen meerdere RNP’s worden gecombineerd als meer dan één locus tegelijkertijd moet worden gericht. Er zijn geen significante verschillen in efficiëntie waargenomen met maximaal drie loci tegelijk. Bereid ondertussen de cellen voor op elektroporatie. Houd de cellen te allen tijde op RT om temperatuurschokken te voorkomen. Oogst de cellen na 48 uur ± 2 uur cultuur in een geschikt vat. Spoel de vaat af met DPBS om het maximale aantal cellen te verzamelen. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 10 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen in DPBS bij ~ 2 x 106 cellen / ml. Combineer 10 μL trypan blue 0,4% oplossing met 10 μL van de celsuspensie en tel met behulp van een hemocytometer.OPMERKING: Verwacht op dit moment, als gevolg van verlies tijdens het oogsten en wassen, ongeveer 60% van de cellen die 48 uur ± 2 uur eerder in cultuur zijn gebracht. Centrifugeer ondertussen de cellen op 200 x g gedurende 10 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en zorg ervoor dat de resterende DPBS wordt geminimaliseerd. Resuspendie van de cellen in voorverwarmde (RT) buffer T bij 5,55 x 107 cellen/ml op basis van het bovenstaande celgetal. Stel het transfectiesysteem in door de machine in te schakelen en in te stellen op 1.350 V, 15 ms en 1 puls. Plaats het pipetstation in de laminaire stromingskap Bereid voor elke set van 10 elektroporaties een transfectiebuis voor met 3 ml buffer E (voor 10 μL transfecties) of E2 (voor 100 μL transfecties). Steek de buis in het pipetstation. Combineer per 10 μL elektroporatie 1,15 μL RNP met 9 μL cellen. Zorg voor voldoende volume (+ 30%) om te voorkomen dat er lucht in de elektroporatietip terechtkomt. Incubeer bij RT gedurende 1-2 minuten voor elektroporatie. Zuig 10 μL of 100 μL RNP en celmengsel aan in de elektroporatiepunt van de juiste grootte op een elektroporatiepipet, steek de geladen pipet in het pipetstation en start de elektroporatie. Zorg ervoor dat de uiteinden volledig vrij zijn van luchtbellen om boogvorming te voorkomen. Kijk tijdens elektroporatie om te controleren of er geen boogvorming optreedt. Werp de geëlektroporeerde cellen onmiddellijk uit in het voorbereide, voorverwarmde, kleine volume medium met of zonder rAAV6 in de 48-well (10 μL transfecties) of 6-well plaat (100 μL transfecties). Herhaal stap 5.15-5.17 met de overige monsters. Voeg controlemonsters zonder transfectie toe aan de kweekputten. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO 2 gedurende 4 uur ±2 uur en voeg vervolgens het bereide, voorverwarmde B-celkweekmedium toe dat stimulerende middelen, DMSO en antibioticum/antimycotica bevat: 450 μL voor 10 μL transfecties of 4,5 ml voor 100 μL transfecties. Zet de incubatie voort bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 12-24 uur. Verander vervolgens het medium in B-celkweekmedium met stimulerende middelen en antibioticum / antimycotica zonder DMSO als langdurig kweken gewenst is. Analyse van het genomische DNA kan na 24 uur worden gedaan. Digitale druppel-PCR met behulp van een primer buiten de homologiearm en een primer in de insert kan worden gebruikt om de bewerkingsefficiëntie te kwantificeren39. Voer PCR’s uit om de invoegsite te versterken en Sanger-sequencing om de juiste bewerking te controleren. Voor de analyse van de eiwitniveaus kweekt u de cellen gedurende 40-48 uur na elektroporatie om eiwitexpressieveranderingen mogelijk te maken en voert u een analyse uit met behulp van flowcytometrie met behulp van de reagentia in tabel 7.