A causa della sua versatile applicazione come specie modello in vari campi di studio, vi è la necessità di un kit di strumenti di trasformazione genetica nella piantaggine a foglia stretta (Plantago lanceolata). Qui, utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens, viene presentato un protocollo che si traduce in linee transgeniche stabili con un’efficienza di trasformazione del 20%.
Le specie del genere Plantago hanno diversi tratti unici che li hanno portati ad essere adattati come piante modello in vari campi di studio. Tuttavia, la mancanza di un sistema di manipolazione genetica impedisce un’indagine approfondita della funzione genica, limitando la versatilità di questo genere come modello. Qui viene presentato un protocollo di trasformazione per Plantago lanceolata, la specie di Plantago più comunemente studiata. Utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens, le radici di 3 settimane di piante di P. lanceolata coltivate asetticamente sono state infettate da batteri, incubate per 2-3 giorni e quindi trasferite in un mezzo di induzione del germoglio con un’appropriata selezione antibiotica. I germogli in genere emergono dal terreno dopo 1 mese e le radici si sviluppano 1-4 settimane dopo che i germogli sono stati trasferiti al mezzo di induzione della radice. Le piante sono state quindi acclimatate in un ambiente del suolo e testate per la presenza di un transgene utilizzando il test reporter β-glucuronidasi (GUS). L’efficienza di trasformazione del metodo attuale è ~ 20%, con due piante transgeniche emergenti ogni 10 tessuti radicali trasformati. Stabilire un protocollo di trasformazione per la piantaggine a foglia stretta faciliterà l’adozione di questa pianta come nuova specie modello in varie aree.
Il concetto di utilizzare specie modello per indagare molteplici aspetti della biologia vegetale è emerso con l’uso diffuso di Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis è stato inizialmente scelto perché condivide caratteristiche con molte altre piante da fiore e ha molteplici tratti che lo rendono conveniente da studiare in un ambiente di laboratorio, come essere piccolo e avere un ciclo di generazione breve. Il grande volume di articoli di ricerca pubblicati con esso come soggetto, insieme alle sue piccole dimensioni del genoma e alla facilità di trasformazione genetica2, gli consentono di persistere come organismo sperimentale ampiamente utilizzato. Tuttavia, Arabidopsis può essere limitato come modello per specie con caratteristiche diverse o tratti unici3. Ciò ha spinto lo sviluppo di nuovi sistemi modello, come il mais (Zea mays), una pianta importante per la genetica dello sviluppo nelle monocotiledoni4, e il pomodoro (Solanum lycopersicum), che è un modello importante per gli studi evolutivi, lo sviluppo dei frutti e la produzione, ed è una buona rappresentazione per le colture orticole5. Un metodo per la trasformazione genetica è un prerequisito affinché una specie vegetale funga da organismo modello2. Una trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens è uno strumento affidabile in biologia vegetale; è stato usato per trasformare alcune specie modello e colture principali, tra cui tabacco (Nicotiana tabacum)6, riso (Oryza sativa)7, cotone (Gossypium hirsutum)8, soia (Glycine max)9, patata (Solanum tuberosum)10 e colza (Brassica napus)11. Le specie vegetali sono molto variabili nel modo in cui rispondono con successo all’infezione da A. tumefaciens e i protocolli di trasformazione spesso devono essere adattati individualmente a ciascuna specie 6,12.
Il genere Plantago comprende un totale di 256 specie di piante, ampiamente distribuite in tutto il mondo13. Le specie di questo genere hanno spesso caratteristiche uniche che le rendono desiderabili come specie modello per lo studio della genetica, dell’ecologia, della fisiologia dello stress, dei metaboliti secondari, della chimica farmaceutica, delle interazioni pianta-microbo, dello sviluppo e dell’evoluzione delle piante. Plantago lanceolata , chiamata anche piantaggine a foglia stretta o ribwort, è stata una pianta popolare di interesse dal 19° secolo, quando è stata usata per la prima volta per descrivere il fenomeno della sterilità maschile14. Come altre piante del suo genere, è stato utilizzato in studi in vari campi di ricerca. Più recentemente, è stato proposto come modello per la biologia vascolare, in quanto il suo tessuto vascolare può essere raccolto facilmente15. P. lanceolata è la specie più comunemente studiata del genere Plantago; un articolo del 2021 ha riferito che c’erano >1.400 pubblicazioni incluse o relative a questa specie in quel momento16, e altri 102 articoli sono stati pubblicati dall’inizio del 2022, secondo una ricerca PubMed condotta il 9dicembre 2022. La seconda pianta più studiata del genere, P. major, è oggetto di soli 414 articoli quando viene ricercata utilizzando gli stessi criteri nella stessa data.
Nonostante l’interesse della ricerca per P. lanceolata, gli studi, in particolare sulla caratterizzazione della funzione genica, sono spesso limitati dalla mancanza di un kit di strumenti di manipolazione genetica per la specie. Pommerrienig et al. hanno fatto sforzi per sviluppare un protocollo di trasformazione per P. major usando una tecnica di immersione floreale17. Tuttavia, questo metodo non può essere applicato a P. lanceolata a causa della sterilità maschile caratteristica di questa specie18,19. Per quanto ne sappiamo, non esiste un protocollo esistente per la trasformazione di P. lanceolata.
Questo studio presenta un semplice protocollo per la trasformazione mediata da A. tumefaciens di P. lanceolata. Prendendo di mira i tessuti radicali, le piante transgeniche completamente cresciute possono essere generate entro 3 mesi dalla trasformazione.
La mancanza di un protocollo di trasformazione per le piante del genere Plantago limita l’uso di queste piante come modelli, in particolare quando i ricercatori sono interessati ad esplorare le funzioni geniche. P. lanceolata è stata scelta per sviluppare un protocollo di trasformazione genetica perché è la pianta più comunemente studiata del suo genere16. Il protocollo che è stato sviluppato sarà probabilmente utilizzato come strumento per far progredire ulteriormente gli studi relativi alla biologia vascolare, all’ecologia, alle interazioni pianta-insetto e alla fisiologia dello stress abiotico.
Il protocollo presentato delinea chiaramente i passaggi che consentono a un utente di ottenere piante transgeniche. Oltre alla capacità di P. lanceolata di prosperare in un ambiente di coltura tissutale, molteplici fattori hanno contribuito al successo del nostro metodo di trasformazione. In primo luogo, è stata osservata l’importanza di utilizzare tessuto radicale vegetale sterile di alta qualità per la trasformazione. Le radici hanno avuto i più alti tassi di trasformazione quando sono state prese da piante di 3-4 settimane e apparivano verdi o bianche pallide. Le radici prelevate da scatole con qualsiasi quantità di contaminazione batterica o fungina spesso hanno portato a colture di tiro contaminate e le radici più vecchie che apparivano marroni non hanno portato a una trasformazione di successo. Il tessuto radicale era il tipo di tessuto più efficiente per la trasformazione utilizzando il metodo attuale, poiché il tessuto fogliare e picciolo non aveva successo nello sviluppo di germogli.
Un’altra osservazione importante era che il metodo ottimale per raccogliere il tessuto radicale per la trasformazione era quello di mettere materiale radicolare appena tagliato in acqua sterile. Questo passaggio ha effettivamente permesso al materiale radicale di rimanere idratato mentre il resto del tessuto è stato raccolto, poiché le radici tendono ad asciugarsi rapidamente quando vengono rimosse dai loro contenitori di crescita. Questo passaggio ha anche contribuito ad aumentare il tasso di successo della trasformazione, perché ha permesso di incubare più radici nei batteri contemporaneamente.
Questo protocollo potrebbe essere modificato riducendo il tempo che il tessuto radicolare incuba nei terreni di co-coltura a 2 giorni. È stato osservato che un periodo di incubazione di 2 o 3 giorni è sufficiente per consentire l’infezione che si traduce in iniziali di germoglio. Tuttavia, i tempi di incubazione più lunghi non sono raccomandati, poiché è stato osservato che l’assenza di un inibitore antibiotico nei media spesso provoca una crescita eccessiva di A. tumefaciens , che può uccidere il tessuto emergente.
Una limitazione di questo studio è la mancanza di dati disponibili sulle prestazioni di altri metodi o specie di A. tumefaciens nella trasformazione di P. lanceolata per il confronto. Per quanto ne sappiamo, questo protocollo è nuovo. Durante le prove iniziali, è stata notata un’elevata efficienza di trasformazione con A. tumefaciens GV3101 e ci siamo concentrati sul perfezionamento della tecnica utilizzando questo ceppo invece di sperimentare con altri ceppi. La nostra efficienza di trasformazione del 20% è relativamente elevata per la trasformazione degli impianti: molti metodi convenzionali considerano qualsiasi >1% di successo26,27,28. Tuttavia, l’utilizzo di un altro ceppo di A. tumefaciens, come A. rhizogenes, noto per il suo uso nella trasformazione delle radici in più specie 29,30,31, può comportare un tasso di successo ancora più elevato. Saranno necessarie ulteriori sperimentazioni per valutare l’impatto dell’uso di altri ceppi per promuovere una maggiore efficienza di trasformazione in P. lanceolata.
Il successo della trasformazione di P. lanceolata andrà probabilmente a beneficio di molti campi di studio. L’elevata efficienza di trasformazione e la rapida crescita della pianta nei terreni di coltura tissutale rendono P. lanceolata un candidato fattibile per gli studi sulla funzione genica15.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (EDGE IOS-1923557 a C.Z. e Y.Z.).
14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34 | ThermoFisher Scientific | 150268 | |
1-Naphthylacetic acid | Gold Biotechnology | N-780 | |
3M Micropore Surgical Paper Tape | ThermoFisher Scientific | 19-027761 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Research Products International Corp. | 163227LC | |
600 Watt High Pressure Sodium Lights | Plantmax | PX-LU600 | |
6-Benzylaminopurine (6-BAP) | Gold Biotechnology | B-110 | |
Aluminum Foil | ThermoFisher Scientific | 01-213-100 | |
Bacto Agar | Thermofisher Scientific | 214010 | |
Binary Plasmid pBI101 | Clontech, USA | 632522 | |
Cool White Grow Light Sylvania LLC | Home Depot | 315952205 | |
D-biotin | ThermoFisher Scientific | BP232-1 | |
ddH2O | |||
DH5a E. coli | Invitrogen, USA | 18258012 | |
Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875714G | |
Dissecting Scissors | Leica Biosystems | 38DI12044 | |
Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705 | |
Folic Acid | Fisher Scientific | BP2519-5 | |
Forceps | Leica Biosystems | 38DI18031 | |
Gelrite | Research Products International Corp. | G35020-1000 | |
Glycerol | ThermoFisher Scientific | 17904 | |
Glycine | Sigma | 241261 | |
Incubated Tabletop Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | SHKE420HP | |
Indole-3-Acetic Acid (IAA) | Gold Biotechnology | I-110 | |
Indole-3-Butyric Acid (IBA) | Gold Biotechnology | I-180 | |
Kanamycin Monosulfate | Gold Biotechnology | K-120 | |
Macrocentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
Magenta Boxes | ThermoFisher Scientific | 50255176 | |
Micro Pipet Tips 1000 µL | Corning | 4140 | |
Micro Pipet Tips 200 µL | Corning | 4138 | |
Micro Pipette Tips 10 µL | Corning | 4135 | |
Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002410 | |
Micropipettor 0.5-10 µL | Corning | 4071 | |
Micropipettor 100-1000 µL | Corning | 4075 | |
Micropipettor 20-200 µL | Corning | 4074 | |
Micropipettor 2-20 µL | Corning | 4072 | |
Murashige & Skooge Basal Medium with Vitamins | PhytoTech | M519 | |
Murashige & Skooge Basal Salt Mixture | PhytoTech | M524 | |
myo-Inositol | Gold Biotechnology | I-25 | |
Nicotinic acid | Sigma | N0761-100g | |
Parafilm (paraffin film) | ThermoFisher Scientific | S37440 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Research Products International Corp. | P44000 | |
Pyridoxine HCl | Sigma | P6280-10g | |
Scalpel Blade Handle | Leica Biosystems | 38DI36419 | |
Scalpel Blades | Leica Biosystems | 3802181 | |
Sodium Chloride, Crystal (NaCl) | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Research Products International Corp. | S24000 | |
Sodium Hypochlorite | Walmart | 23263068401 | |
Soil- Bark Mix | Berger, USA | BM7 | |
Square Pots (3.5 inches squared) | Greenhouse Megastore | CN-TRK-1835 | |
Sucrose | Research Products International Corp. | S24060 | |
Thermocycler | ThermoFisher Scientific | A24811 | |
Thiamine HCl | Sigma | T4625-5G | |
Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin) | Gold Biotechnology | T-104 | |
trans-Zeatin Riboside (ZR) | Gold Biotechnology | Z-100 | |
Tryptone | Thermofisher Scientific | 211705 | |
Wild Type Plantago lanceolata seeds | Outsidepride Seed Source, OR, USA | F1296 | Outsidepride.com |
Yeast Extract Granulated | Research Products International Corp. | Y20025-1000 |