アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介したナローリーフオオバコの遺伝子形質転換

注意: 手順1.4-1.8、2.3-2.5、3.3-3.6、4.1-4.6、5.1-5.7、および6.1-6.3は、汚染を防ぐために清潔なフードを使用して、無菌状態で実行する必要があります。 1. 形質転換のための植物材料増殖 市販の野生型(WT)オオ バコランセオラータ 種子( 材料の表を参照)を、希望する植物の数に応じて、50 mLラインまで50 mL遠沈管に入れます。注:または、少数の種子が必要な場合は2 mLの微量遠心チューブを使用できますが、種子が多すぎると滅菌の効率が低下する可能性があるため、0.1 mL以下の容量に充填する必要があります。 種子を75%エタノールに60秒間浸します。 エタノールを廃棄し、種子を20%次亜塩素酸ナトリウム(20%NaClO、80%滅菌水)に40分間浸し、すべての種子が溶液と接触するようにチューブを静かに反転させます。注意: 次亜塩素酸ナトリウム溶液は、最適な結果を得るために新たに作成する必要があります。 層流フードの下で、次亜塩素酸ナトリウム溶液を捨て、次に種子を蒸留水で洗います(5回)。最後のすすぎの後、種子に少量の水を追加します, これはプレートへの植物の移動を助けるのに役立ちます. 滅菌した鉗子を使用して、種子を固体MS培地で事前に準備された95 mm x 100 mmのペトリ皿に移します(表1)。発芽した苗の過密を防ぐために、各種子の間に約1 cmの間隔で、プレートの表面全体に種子を均等に広げます(図1A)。 汚染を防ぐために2層のパラフィンフィルムでプレートを密封し、室温(22°C、50 μmol m-2 s-1、12時間)で冷白色のグローライト(材料の表を参照)の下でインキュベートします。種子は通常5〜6日以内に発芽します。 苗が発芽し、移すのに十分な大きさになったら(図1B)、通常は発芽後2〜3日で、滅菌した鉗子を使用して、50〜100 mLのMS培地を入れた滅菌箱に苗を移します(表1)。理想的には、最高品質の根を得るために箱ごとに5本の苗だけを植えます。 箱をサージカルテープで密封し、次に、ステップ1.6で説明したのと同じ条件で、涼しい白いグローライトの下で植物を成長させます( 材料の表を参照)。植物は約3〜4週間で、または主根の長さが約2 cm成長し、側根が白く見えるときに形質転換の準備ができているはずです。注:培地調製レシピとビタミンストックは 、表1 と 表2に含まれています。 2. プラスミド構築と 大腸菌 形質転換 注:正確なプラスミド構築手順は、目的の遺伝子によって異なります。この手順では、制限酵素HindIIIおよびSalIIを使用して、標準的なクローニング手順20を使用して、1.5kbのAtPP2プロモーターをGUSと共にバイナリプラスミドpBI101(材料表を参照)に挿入しました。AtPP2(師部タンパク質2)は、師部21に特異的に発現する遺伝子である。 シロイヌナズナ由来のプライマーペア5′-AGTCAAGCTTCAAGTCCGTGGCTACTGAAC-3′(フォワード)および5′-AGTCGTCGACAAACCAACCATGATATTATTTTTG-3′(リバース)を用いてプロモーターをクローニングする。図2は、AtPP2:GUSインサートを有するバイナリプラスミドベクターのダイアグラムを示す。 プラスミド構築後、ヒートショック法22を用いてプラスミドをDH5a E.coliコンピテントセル(材料の表を参照されたい)に形質転換し、次いで振とう(150rpm)しながら37°Cで1.5時間インキュベートする。 各形質転換培養液150 μLを取り、適切な選択(このプロトコルで使用される菌株に対して50 mg/Lカナマイシン;材料の表を参照)でLB寒天培地プレート(表1)にプレートし、プレートを37°Cで16〜24時間インキュベートします。注:この研究で使用された細菌株は A.ツメファシエンス GV3101です。 次に、コロニーPCRを用いて、陽性組換え体23についてコロニーをスクリーニングする。注:このプロトコルでは、以下のプライマーを使用して標的遺伝子を増幅しました。5′-ATGTTACGTCCTTAGAGAAACCCCAA-3′(フォワード)および5′-TCATTGTTTGCCTCCTGCTGC-3′(リバース)。サーモサイクラー( 材料表を参照)で95°Cで3分間のサイクル条件で反応を実行し、続いて95°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで2分、および72°Cで最後の10分間の伸長ステップを35サイクル行います。 陽性コロニーを6 mLのLBブロス(表1)に適切な抗生物質(50 mg / Lカナマイシン)を接種し、37°Cで200〜250 rpmで一晩増殖させます。 一晩増殖した後、標準的な手順24を用いて細菌からプラスミドを抽出する。 3. A.プラスミドによるツメファシエンス の形質転換 プラスミド抽出後、エレクトロポレーションを使用して、修飾プラスミドを目的のコンピテントセル株に形質転換します。この手順では、 A.ツメファシエンス 株GV3101を使用した。エレクトロポレーション技術の標準化された方法に従う25。 エレクトロポレーション後、コンピテントセルを1 mLのLBブロスに再懸濁し、28°C、100 rpmで2〜4時間インキュベートします。 室温(22°C)の卓上マイクロ遠心分離機(材料の表を参照)で6,800 x gで3分間遠心分離して細胞を収集し、適切な選択剤(このプロトコルで使用されるプラスミドには50 mg / Lカナマイシン)を含むLB寒天プレートに50〜100 μLを広げます。 細胞を28°Cで2日間インキュベートした後、コロニーPCRを使用して目的の遺伝子を含む陽性コロニーを同定する。このプロトコルでは、ステップ2.4に記載されているプライマーと条件を使用します。 次に、ポジティブコロニーを使用して、LB寒天培地+選択でストックプレートをストリークします。プレートは4°Cで最大1ヶ月間保存できます。 あるいは、長期保存のために、適切な選択で少量のLBを陽性コロニーに接種する。接種培養液を28°C、200rpmで一晩振とうし、-80°Cで最大10年間保存できるグリセロールストック(細菌とグリセロールの50:50混合物中の50%w/vグリセロール)を調製します。 4. A.ツメファシエンス の準備 目的のプラスミドを含むストリーク A.ツメファシエンスを 、適切な選択剤を使用して準備した95 mm x 100 mmの固体LBプレート上に配置します。このプロトコルでは、プラスミドインサート AtPP2:GUS を有する細菌株GV3101を使用し、50 mg/Lのカナマイシンを選択して追加しました。 プレートをパラフィンフィルムで密封し、28°Cで最大48時間、またはバクテリアがピッキングするのに十分な大きさになるまでインキュベートします。 形質転換の2日前にピペットチップを使用して細菌コロニーを選び、適切な選択で6 mLの液体LBを含む15 mLの丸底チューブに接種します。OD 200が0.6〜0.7に達するまで、28 °Cの卓上シェーカーで200rpmで一晩振とうします。注:プレートと6 mLの細菌接種は、4°Cで最大1か月間保存できます。 細菌が正しいOD 600に達したら、ピペットを使用して、選択剤を含む100 mLの液体LBを含む滅菌フラスコに A.ツメファシエンス を移します。通常、100 mL LBあたり200 μLの細菌が増殖に適しています。OD 200が0.6〜0.7に達するまで、28°Cで200rpm で一晩振とうします。 菌を50 mL滅菌遠心チューブに移し、卓上遠心分離機で室温(22°C)で2,200 xg で10分間遠心分離し、菌を回収します。 ピペットを使用して上清を捨てる。ピペッティングにより細菌ペレットを5 mLの室温(22°C)液体懸濁溶液(SS)(表1)に再懸濁し、次に最大50 mLのSSを加え、数回反転させて混合します。これで、バクテリアは形質転換の準備が整いました。注:液体SSは、形質転換から1週間以内に新たに調製する必要があります。注意: A. tumefaciensと 接触するすべての材料は、バイオハザード廃棄物箱に廃棄する必要があります。細菌培養液の残り液は、次亜塩素酸ナトリウム(漂白剤)で20%以上の濃度で殺菌することができます。 5. オ オバコ の根の形質転換 植物が形質転換の理想的な段階(苗は3週齢)に達したら(図1C)、滅菌鉗子とはさみを使用して根を植物の他の部分から分離します(図3A)。葉と茎の材料を捨てます。 切断直後に、滅菌鉗子を使用して滅菌水の入った滅菌箱に根片を移します。このステップにより、すべての組織が収集されている間、根は水分補給されたままになります。 すべての根が切断されたら、 A.ツメファシエンス/ SS懸濁液を滅菌済みの150 mm x 15 mmの使い捨てペトリ皿に注ぎます。根を A.ツメファシエンス 培養物に移し、少なくとも20分間接種します(図3B)。 インキュベーション中に、鋭利な刃の付いた滅菌メスを使用して根を1 cmの断片に切り、一次根を側根から分離します。根の表面に薄くて浅い切り込みを入れて、バクテリアが植物に感染できるようにします。注:多数の植物を扱う場合は、接種中にすべての根が浸るように、根片をバッチで細菌培養物に移します。 インキュベーション後、滅菌鉗子を使用して根片を滅菌ペーパータオルに移し、余分な細菌を除去します。根を60秒以上乾燥させると、脱水症状を引き起こし、根の組織が損傷する可能性があるため、避けてください。理想的には、10〜15本の根を同時に乾燥させることができます(図3C)。 乾燥した根を、根のサイズに応じて、プレートあたり約10〜20本の根で、固体共培養培地(表1)で準備した95 mm x 15 mmのペトリ皿に移します(図3D)。 プレートを2層の透明プラスチックフィルムで密封し、アルミホイルで覆います。室温(22°C)で3日間インキュベートします。このステップは、抗生物質の選択なしに細菌が根に感染する時間を提供します(図3E)。 6.選択と植物全体の再生 共培養培地でインキュベートした後、根片を、固体シュート誘導培地(SIM)(表1)とタイメンチン(500 mg / L; 材料の表を参照)と適切な抗生物質の選択を含む準備された95 mm x 15 mmのペトリ皿に移します。このプロトコルでは、カナマイシン(100 mg / L)を使用しました。注意: 根の底は培地と完全に接触している必要があります。培地の表面に触れない根は長すぎるため、組織が選択から逃れるのを防ぐために切断する必要があります。 プレートを2層の透明なプラスチックフィルムで密封し、次にグローライトの下で1か月間(適切な条件についてはステップ1.6を参照)、または芽が出始めるまで成長します。注:通常、シュートのイニシャルは成長の2週間後に観察でき、シュートは通常1か月後に見えます。 小植物の長さが1.5〜2.0 cmになったら(図1D)、固体根誘導培地で準備した滅菌箱に移します(表1)。 グローライトの下で植物を育てます (条件についてはステップ1.6を参照) 数週間, 根が形成されるまで.根は通常1週間後に最初に見ることができます。注:根系が大きい植物は土壌での生存率が高くなる傾向があるため、土壌に移動する前に根を数週間成長させることをお勧めします。 7.土壌移動 根系が移動できるほど大きくなったら(図1E)、通常は1か月の成長後、事前に濡れた万能土壌(BM7)を含む四角い鉢に植物を3.5に移します。このプロトコルでは、BM7樹皮ミックスが使用されました( 材料の表を参照)。根に付着している培地を水でやさしく洗って取り除きます。注:植物は、600 Wの高ナトリウム圧ライト(材料の表を参照)を使用して800〜1400 μmol光子m-2 s-2の温室で、または室温(22°C)の成長チャンバーで50 μmol m-2 s-1の冷たい白色光で、12時間日間成熟させることができます。 植物をプラスチック製の培養土カバーで覆い、次に透明なビニール袋で覆います。このステップにより、植物は土壌に適応するため、湿った環境にとどまることができます。 約3〜5日後、ビニール袋を取り外し、蓋をゆっくりと取り外して、外部環境に順応させます。注意: 一年の時期と植物が移される環境に応じて、植物が適応する必要がある時間は異なる場合があります。毎日植物をチェックし、必要に応じて鉢に水を加えることをお勧めします。 定期的に植物に水をやり、必要に応じて肥料を加えます。植物は、さらなる成長のためにより大きな鉢に移すこともできます(図1F)。 8.β-グルクロニダーゼ(GUS)組織化学染色 公開されているプロトコル15に従って、β-グルクロニダーゼ(GUS)染色溶液を調製します。 シュートのイニシャルの長さが約0.5〜1 cmになったら、完全に拡張した若い葉の小さな先端を取り除き(通常は長さ<5 mmで十分です)、すぐに1.5または2 mLの微量遠心チューブ内の0.5〜1 mLのGUS染色液に移します。溶液は植物組織を完全に覆うべきです。 開いたチューブを真空デシケーターに入れ、20〜25 kPaで5〜10分間真空にします。真空手順中に溶液中に小さな気泡が見えるはずです。これにより、溶液が植物の細胞に入ることができます。 空気をろ過して真空デシケーターに戻します。チューブを閉じ、37°Cで一晩(12時間)、または青色が見えるまでインキュベートします。注:この研究では、GUS活性は師部に局在しており、正に形質転換された植物では、青色の染色は師部組織でのみ見えるはずです。導入遺伝子を持たない植物は染色を受けません(図4)。 汚れをよりよく視覚化するには、植物を100%エタノールに移してクロロフィルを取り除きます。クロロフィル除去プロセスの効率を高めるには、チューブを60°Cで10分間インキュベートします。注:染色される葉のサイズによっては、すべてのクロロフィルを除去する前にエタノールを数回交換する必要がある場合があります。