Transformation génétique médiée par Agrobacterium tumefaciens du plantain à feuilles étroites

NOTA: Les étapes 1.4-1.8, 2.3-2.5, 3.3-3.6, 4.1-4.6, 5.1-5.7 et 6.1-6.3 doivent être effectuées dans des conditions aseptiques, en utilisant une hotte propre pour éviter toute contamination. 1. Propagation du matériel végétal en vue de sa transformation Placer les graines de Plantago lanceolata de type sauvage (WT) disponibles dans le commerce (voir le tableau des matières) dans un tube à centrifuger de 50 ml jusqu’à la ligne de 5 ml, selon le nombre de plantes désirées.REMARQUE : Un tube microcentrifuge de 2 mL peut également être utilisé lorsqu’un petit nombre de graines est nécessaire, mais il doit être rempli à un volume ne dépassant pas 0,1 mL, car trop de graines peut réduire l’efficacité de la stérilisation. Plongez les graines dans de l’éthanol à 75% pendant 60 s. Jeter l’éthanol, puis immerger les graines dans de l’hypochlorite de sodium à 20% (20% de NaClO, 80% d’eau stérile) pendant 40 min, en retournant doucement le tube pour que toutes les graines entrent en contact avec la solution.REMARQUE: La solution d’hypochlorite de sodium doit être fraîchement préparée pour des résultats optimaux. Sous une hotte à flux laminaire, jeter la solution d’hypochlorite de sodium, puis laver les graines avec de l’eau distillée (cinq fois). Ajoutez un petit volume d’eau aux graines après le rinçage final, car cela peut aider à faciliter le mouvement des plantes sur les assiettes. À l’aide de pinces stérilisées, transférer les graines sur des boîtes de Petri de 95 mm x 100 mm préparées à l’avance avec un milieu solide de SEP (tableau 1). Répartir les graines uniformément sur la surface de la plaque, avec environ 1 cm entre chaque graine pour éviter le surpeuplement des plantules germées (figure 1A). Sceller les plaques avec deux couches de film de paraffine pour éviter la contamination, puis incuber sous une lampe de culture blanche froide (voir le tableau des matériaux) à température ambiante (22 °C avec 50 μmol m-2 s-1, 12 h jours). Les graines germent généralement dans les 5-6 jours. Lorsque les plantules ont germé et sont assez grosses pour être transférées (figure 1B), habituellement 2 ou 3 jours après la germination, utilisez des pinces stérilisées pour transférer les plantules dans des boîtes stériles contenant 50 à 100 ml de milieu de SP (tableau 1). Idéalement, plantez seulement cinq plants par boîte pour obtenir des racines de la meilleure qualité. Scellez les boîtes avec du ruban chirurgical, puis laissez les plantes pousser sous une lumière de culture blanche et froide (voir le tableau des matériaux), dans les mêmes conditions que celles mentionnées à l’étape 1.6. Les plantes devraient être prêtes pour la transformation dans environ 3-4 semaines, ou lorsque les racines principales ont atteint environ 2 cm de longueur et que les racines latérales apparaissent blanches.REMARQUE : Les recettes de préparation moyenne et les stocks de vitamines sont inclus dans les tableaux 1 et 2. 2. Construction plasmidique et transformation d’E. Coli REMARQUE: La procédure exacte de construction plasmidique varie en fonction du gène d’intérêt. Dans cette procédure, les enzymes de restriction HindIII et SalII ont été utilisées pour insérer le promoteur AtPP2 de 1,5 kb dans le plasmide binaire pBI101 (voir le tableau des matériaux) avec GUS, en utilisant la procédure de clonage standard20. AtPP2 (phloème protein 2) est un gène spécifiquement exprimé dans le phloème21. Cloner le promoteur en utilisant les paires d’amorces 5′-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3′ (avant) et 5′-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGTATTTATTTTTG-3′ (revers) d’Arabidopsis. La figure 2 montre un diagramme du vecteur plasmidique binaire avec l’insert AtPP2:GUS . Après la construction plasmidique, transformer les plasmides en cellules compétentes DH5a E. coli (voir tableau des matériaux) en utilisant la méthode du choc thermique22, puis incuber pendant 1,5 h à 37 °C en agitant (150 tr/min). Prélever 150 μL de chaque culture de transformation, plaquer sur des plaques de milieu gélose LB (tableau 1) avec la sélection appropriée (50 mg/L de kanamycine pour la souche utilisée dans ce protocole; voir le tableau des matériaux), puis incuber les plaques pendant 16-24 h à 37 °C.REMARQUE : La souche bactérienne utilisée dans cette étude est A. tumefaciens GV3101. Ensuite, utilisez la PCR des colonies pour dépister les colonies pour les recombinants positifs23.REMARQUE : Dans ce protocole, les amorces suivantes ont été utilisées pour amplifier le gène ciblé ; 5′-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3′(avant) et 5′-TCATTGTTTGCCTCTGCTGC-3′ (arrière).Exécuter la réaction dans un thermocycleur (voir le tableau des matériaux) avec des conditions de cyclage de 3 min à 95 °C, suivies de 35 cycles de : 30 s à 95 °C, 30 s à 55 °C, 2 min à 72 °C et une dernière étape d’allongement de 10 min à 72 °C. Inoculer les colonies positives dans 6 mL de bouillon LB (tableau 1) avec l’antibiotique approprié (50 mg/L de kanamycine) et augmenter à 37 °C pendant la nuit, à 200-250 rpm. Après une croissance nocturne, extraire les plasmides des bactéries en utilisant les procédures standard24. 3. Transformation d’A. tumefaciens avec plasmide Après l’extraction plasmidique, utilisez l’électroporation pour transformer le plasmide modifié en la souche désirée de cellules compétentes. Dans cette procédure, la souche GV3101 de A. tumefaciens a été utilisée. Suivre des méthodes normalisées pour les techniques d’électroporation25. Après électroporation, remettre en suspension les cellules compétentes dans 1 mL de bouillon LB, puis incuber pendant 2-4 h à 28 °C à 100 rpm. Recueillir les cellules par centrifugation à 6 800 x g pendant 3 minutes dans une microcentrifugeuse de table (voir le tableau des matériaux) à température ambiante (22 °C), puis étaler 50 à 100 μL sur une plaque de gélose LB avec un agent de sélection approprié (50 mg/L de kanamycine pour le plasmide utilisé dans ce protocole). Après l’incubation des cellules pendant 2 jours à 28 °C, identifier les colonies positives contenant le gène d’intérêt grâce à l’utilisation de la PCR des colonies. Dans ce protocole, utilisez les amorces et les conditions mentionnées à l’étape 2.4. Ensuite, utilisez les colonies positives pour strier une plaque de stock avec LB agar media + selection. La plaque peut être conservée à 4 °C jusqu’à 1 mois. Alternativement, pour un stockage à long terme, inoculer une colonie positive avec un petit volume de LB avec une sélection appropriée. Agiter la culture inoculée pendant une nuit à 28 °C à 200 tr/min, puis préparer un stock de glycérol (50 % p/v de glycérol dans un mélange 50:50 de bactéries et de glycérol), qui peut être conservé à -80 °C jusqu’à 10 ans. 4. Préparation d’A. tumefaciens Stries A. tumefaciens contenant le plasmide désiré sur des plaques LB solides préparées de 95 mm x 100 mm avec l’agent de sélection approprié. Dans ce protocole, la souche bactérienne GV3101 avec l’insert plasmidique AtPP2:GUS a été utilisée, avec 50 mg/L de kanamycine ajoutée pour la sélection. Sceller les plaques avec un film de paraffine, puis incuber à 28 °C pendant 48 h ou jusqu’à ce que les bactéries deviennent suffisamment grosses pour être cueillies. Utilisez un embout de pipette pour prélever une colonie de bactéries 2 jours avant la transformation et inoculez-la dans un tube à fond rond de 15 ml contenant 6 ml de LB liquide avec une sélection appropriée. Agiter à 200 tr/min dans un agitateur de table à 28 °C pendant une nuit, jusqu’à ce que le diamètre de600 atteigne 0,6-0,7.REMARQUE : Les plaques et l’inoculation bactérienne de 6 mL peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 1 mois. Lorsque les bactéries atteignent la bonne DO 600, utiliser une pipette pour transférer A. tumefaciens dans une fiole stérile contenant100 mL de LB liquide avec un agent de sélection. En règle générale, 200 μL de bactéries par 100 mL de LB conviennent à la propagation. Agiter à 200 tr/min à 28 °C pendant une nuit, jusqu’à ce que le diamètre de600 atteigne 0,6-0,7. Transférer les bactéries dans des tubes à centrifuger stériles de 50 ml et centrifuger à 2 200 xg pendant 10 minutes à température ambiante (22 °C) dans une centrifugeuse de table pour recueillir les bactéries. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Remettez en suspension la pastille bactérienne dans 5 mL de solution de suspension liquide (SS) à température ambiante (22 °C) (tableau 1) par pipetage, puis ajoutez jusqu’à 50 mL de SS et retournez plusieurs fois pour mélanger. La bactérie est maintenant prête pour la transformation.NOTE: Le SS liquide doit être préparé frais, dans la semaine 1 suivant la transformation.MISE EN GARDE : Tout matériel qui entre en contact avec A. tumefaciens doit être jeté dans une poubelle à déchets présentant un risque biologique. Les restes liquides de cultures bactériennes peuvent être stérilisés avec de l’hypochlorite de sodium (eau de Javel) à une concentration de 20 % ou plus. 5. Transformation des racines de Plantago Lorsque les plantes atteignent le stade idéal de transformation (les semis ont 3 semaines) (figure 1C), utilisez des pinces et des ciseaux stériles pour séparer les racines du reste de la plante (figure 3A). Jeter la feuille et le matériau de la tige. Immédiatement après la coupe, transférer les morceaux de racines dans des boîtes stériles contenant de l’eau stérile à l’aide de pinces stériles. Cette étape permet aux racines de rester hydratées pendant que tous les tissus sont collectés. Lorsque toutes les racines sont coupées, verser la suspension A. tumefaciens/SS dans des boîtes de Petri jetables stériles de 150 mm x 15 mm. Transvaser les racines dans la culture A. tumefaciens et inoculer pendant au moins 20 minutes (figure 3B). Pendant l’incubation, utilisez un scalpel stérile avec une lame tranchante pour couper les racines en fragments de 1 cm, en séparant les racines primaires des racines latérales. Faites des coupes minces et peu profondes à la surface des racines pour permettre aux bactéries d’infecter la plante.REMARQUE: Si vous avez affaire à un grand nombre de plantes, transférez les morceaux de racines dans la culture bactérienne par lots, pour vous assurer que toutes les racines sont immergées pendant l’inoculation. Après l’incubation, utilisez les pinces stériles pour transférer les morceaux de racines dans des serviettes en papier stériles afin d’éliminer l’excès de bactéries. Évitez de sécher les racines pendant plus de 60 s, car cela peut provoquer une déshydratation et endommager le tissu racinaire. Idéalement, 10 à 15 racines peuvent être séchées simultanément (figure 3C). Transférer les racines séchées dans des boîtes de Petri préparées de 95 mm x 15 mm avec des milieux de coculture solides (tableau 1), environ 10 à 20 racines par assiette, selon la taille des racines (figure 3D). Scellez les plaques avec deux couches de film plastique transparent, puis recouvrez de papier d’aluminium. Incuber à température ambiante (22 °C) pendant 3 jours. Cette étape laisse le temps aux bactéries d’infecter les racines sans la présence d’une sélection d’antibiotiques (Figure 3E). 6. Sélection et régénération de plantes entières Après l’incubation dans des milieux de coculture, transférer les morceaux de racines dans des boîtes de Petri préparées de 95 mm x 15 mm avec des milieux d’induction de pousses solides (SIM) (tableau 1) avec de la timentine (500 mg/L; voir le tableau des matériaux) et une sélection appropriée d’antibiotiques. Dans ce protocole, nous avons utilisé la kanamycine (100 mg/L).NOTE: Le bas des racines doit entrer en contact complet avec le milieu. Les racines qui ne touchent pas la surface du milieu sont trop longues et doivent être coupées pour éviter que le tissu n’échappe à la sélection. Scellez les plaques avec deux couches de film plastique transparent, puis cultivez sous une lampe de culture pendant 1 mois (voir étape 1.6 pour les conditions appropriées), ou jusqu’à ce que les pousses commencent à émerger.REMARQUE: En règle générale, les initiales des pousses peuvent être observées après 2 semaines de croissance, et les pousses sont généralement visibles après 1 mois. Lorsque les plantules mesurent de 1,5 à 2,0 cm de long (figure 1D), transférez-les dans des boîtes stériles préparées avec un milieu d’induction racinaire solide (tableau 1). Cultivez les plantes sous une lumière de culture (voir l’étape 1.6 pour connaître les conditions) pendant plusieurs semaines, jusqu’à ce que les racines se forment. Les racines peuvent généralement être vues pour la première fois après 1 semaine.REMARQUE: Il est recommandé de laisser pousser les racines pendant plusieurs semaines avant de se déplacer vers le sol, car les plantes ayant un système racinaire plus gros ont tendance à avoir un taux de survie plus élevé dans le sol. 7. Transfert de sol Lorsque les systèmes racinaires sont devenus assez gros pour être transférés (figure 1E), généralement après 1 mois de croissance, transférer les plantes dans 3,5 dans des pots carrés contenant de la terre tout usage pré-mouillée (BM7). Dans ce protocole, un mélange d’écorce BM7 a été utilisé (voir le tableau des matériaux).Enlevez tout milieu qui colle aux racines en les lavant doucement à l’eau.NOTE: Les plantes peuvent être cultivées jusqu’à maturité dans une serre à 800 à 1400 μmol photons m-2 s-2 en utilisant des lampes à haute pression de sodium de 600 W (voir le tableau des matériaux), ou dans une chambre de croissance à température ambiante (22 ° C) avec des lumières blanches froides à 50 μmol m-2 s-1, 12 h jours. Couvrez les plantes avec un terreau en plastique, puis couvrez-les avec un sac en plastique transparent. Cette étape permet aux plantes de rester dans un environnement humide pendant qu’elles s’adaptent au sol. Après environ 3 à 5 jours, retirez le sac en plastique, puis retirez lentement le couvercle pour permettre l’acclimatation à l’environnement extérieur.NOTE: Selon la période de l’année et l’environnement dans lequel les plantes sont transférées, le temps que les plantes doivent s’adapter peut varier. Il est recommandé de vérifier les plantes quotidiennement et d’ajouter de l’eau aux pots au besoin. Arrosez les plantes régulièrement et ajoutez de l’engrais au besoin. Les plantes peuvent également être transférées dans des pots plus grands pour une croissance ultérieure (Figure 1F). 8. Coloration histochimique de la β-glucuronidase (GUS) Préparer la solution de coloration β-glucuronidase (GUS), conformément aux protocoles publiés15. Lorsque les initiales des pousses mesurent environ 0,5 à 1 cm de long, retirer une petite extrémité d’une jeune feuille complètement expansée (<5 mm de longueur est généralement suffisante) et transférer immédiatement dans 0,5 à 1 mL de solution de coloration GUS dans un tube microcentrifuge de 1,5 ou 2 mL. La solution doit couvrir entièrement le tissu végétal. Placer les tubes ouverts dans un dessiccateur à vide et vide à 20-25 kPa pendant 5-10 min. De petites bulles doivent être visibles dans la solution pendant la procédure de vide. Cela permet à la solution d’entrer dans les cellules de la plante. Laissez l’air filtrer à nouveau dans le dessiccateur sous vide. Fermer les tubes et incuber à 37 °C pendant une nuit (12 h), ou jusqu’à ce que la couleur bleue soit visible.REMARQUE: Dans cette étude, l’activité GUS a été localisée au phloème, ce qui signifie que chez les plantes transformées positivement, la coloration bleue ne devrait être visible que dans le tissu du phloème. Les plantes sans transgène ne subissent pas de coloration (Figure 4). Pour mieux visualiser la tache, transférez les plantes à 100% éthanol pour éliminer la chlorophylle. Pour augmenter l’efficacité du processus d’élimination de la chlorophylle, incuber les tubes à 60 °C pendant 10 min.REMARQUE: L’éthanol peut devoir être changé plusieurs fois avant que toute la chlorophylle ne soit enlevée, selon la taille de la feuille colorée.