Agrobacterium tumefaciens-vermittelte genetische Transformation des Spitzwegerichs

Anmerkungen: Die Schritte 1.4-1.8, 2.3-2.5, 3.3-3.6, 4.1-4.6, 5.1-5.7 und 6.1-6.3 müssen unter aseptischen Bedingungen unter Verwendung einer sauberen Haube durchgeführt werden, um eine Kontamination zu vermeiden. 1. Vermehrung von Pflanzenmaterial zur Umwandlung Setzen Sie kommerziell erhältliche Wildtyp-Samen (WT) von Plantago lanceolata (siehe Materialtabelle) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen bis zur 5-ml-Linie, abhängig von der Anzahl der gewünschten Pflanzen.HINWEIS: Alternativ kann ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen verwendet werden, wenn eine kleine Anzahl von Samen benötigt wird, aber es sollte auf ein Volumen von nicht mehr als 0,1 ml gefüllt werden, da zu viele Samen die Effizienz der Sterilisation verringern können. Tauchen Sie die Samen 60 s lang in 75%iges Ethanol. Entsorgen Sie das Ethanol und tauchen Sie die Samen 40 Minuten lang in 20%igen Natriumhypochlorit (20% NaClO, 80% steriles Wasser) und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, so dass alle Samen mit der Lösung in Kontakt kommen.Anmerkungen: Die Natriumhypochloritlösung muss frisch hergestellt werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Entsorgen Sie die Natriumhypochloritlösung unter einer Laminar-Flow-Haube und waschen Sie die Samen dann mit destilliertem Wasser (fünfmal). Gib nach dem letzten Spülen eine kleine Menge Wasser zu den Samen, da dies die Bewegung der Pflanzen auf Tellern unterstützen kann. Übertragen Sie die Samen mit einer sterilisierten Pinzette auf vorbereitete 95 mm x 100 mm Petrischalen mit festem MS-Medium (Tabelle 1). Verteilen Sie die Samen gleichmäßig auf der Oberfläche des Tellers, mit einem Abstand von etwa 1 cm zwischen den einzelnen Samen, um ein Überfüllen der gekeimten Sämlinge zu verhindern (Abbildung 1A). Versiegeln Sie die Platten mit zwei Schichten Paraffinfilm, um eine Kontamination zu vermeiden, und inkubieren Sie sie dann unter einem kaltweißen Wachstumslicht (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur (22 °C mit 50 μmol m-2 s-1, 12 h Tage). Die Samen keimen in der Regel innerhalb von 5-6 Tagen. Wenn die Sämlinge gekeimt sind und groß genug sind, um sie zu übertragen (Abbildung 1B), in der Regel 2 oder 3 Tage nach der Keimung, verwenden Sie eine sterilisierte Pinzette, um die Sämlinge mit den 50-100 ml MS-Medium in sterile Boxen zu überführen (Tabelle 1). Pflanzen Sie idealerweise nur fünf Sämlinge pro Kiste, um die besten Wurzeln zu erhalten. Verschließen Sie die Schachteln mit chirurgischem Klebeband und lassen Sie die Pflanzen dann unter einem kaltweißen Wachstumslicht wachsen (siehe Materialtabelle), unter den gleichen Bedingungen, die in Schritt 1.6 erwähnt wurden. Die Pflanzen sollten in etwa 3-4 Wochen bereit für die Transformation sein, oder wenn die Hauptwurzeln etwa 2 cm lang geworden sind und die Seitenwurzeln weiß erscheinen.Anmerkungen: Mittlere Zubereitungsrezepte und Vitaminvorräte sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 enthalten. 2. Plasmidkonstruktion und E. Coli-Transformation HINWEIS: Das genaue Verfahren zur Plasmidkonstruktion variiert je nach interessiertem Gen. In diesem Verfahren wurden die Restriktionsenzyme HindIII und SalII verwendet, um den 1,5 kb AtPP2-Promotor mit GUS unter Verwendung des Standard-Klonierungsverfahrens20 in das binäre Plasmid pBI101 (siehe Materialtabelle) einzuschleusen. AtPP2 (Phloemprotein 2) ist ein Gen, das spezifisch im Phloem21 exprimiert wird. Klonieren Sie den Promotor mit den Primerpaaren 5′-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3′ (Vorwärts) und 5′-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGTATTTTTTTTG-3′ (Rückwärts) aus Arabidopsis. Abbildung 2 zeigt ein Diagramm des binären Plasmidvektors mit dem AtPP2:GUS-Insert . Nach der Plasmidkonstruktion werden die Plasmide mit der Hitzeschockmethode22 in DH5a E. coli (siehe Materialtabelle) kompetente Zellen umgewandelt und anschließend 1,5 h bei 37 °C unter Schütteln (150 U/min) inkubiert. Von jeder Transformationskultur werden 150 μl entnommen, mit der entsprechenden Auswahl (50 mg/l Kanamycin für den in diesem Protokoll verwendeten Stamm; siehe Materialtabelle) auf LB-Agar-Medienplatten (Tabelle 1) plattiert und die Platten dann 16-24 h bei 37 °C inkubiert.HINWEIS: Der in dieser Studie verwendete Bakterienstamm ist A. tumefaciens GV3101. Als nächstes wird die Kolonie-PCR verwendet, um die Kolonien auf positive Rekombinanten zu untersuchen23.HINWEIS: In diesem Protokoll wurden die folgenden Primer verwendet, um das Zielgen zu amplifizieren; 5′-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3′ (vorwärts) und 5′-TCATTGTTTGCCTCCTCCTGCTGC-3′ (rückwärts).Führen Sie die Reaktion in einem Thermocycler (siehe Materialtabelle) mit Zyklusbedingungen von 3 min bei 95 °C durch, gefolgt von 35 Zyklen von: 30 s bei 95 °C, 30 s bei 55 °C, 2 min bei 72 °C und einem abschließenden 10-minütigen Dehnungsschritt bei 72 °C. Die positiven Kolonien werden in 6 ml LB-Bouillon (Tabelle 1) mit dem entsprechenden Antibiotikum (50 mg/l Kanamycin) beimpft und über Nacht bei 37 °C bei 200-250 U/min gezüchtet. Nach dem Wachstum über Nacht werden die Plasmide mit Standardverfahren aus den Bakterien extrahiert24. 3. A . tumefaciens-Transformation mit Plasmid Nach der Plasmidextraktion wird das modifizierte Plasmid mittels Elektroporation in den gewünschten Stamm kompetenter Zellen umgewandelt. In diesem Verfahren wurde der A. tumefaciens-Stamm GV3101 verwendet. Befolgen Sie standardisierte Methoden für Elektroporationstechniken25. Nach der Elektroporation werden die kompetenten Zellen in 1 ml LB-Bouillon resuspendiert und anschließend für 2-4 h bei 28 °C bei 100 U/min inkubiert. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.800 x g für 3 min in einer Tisch-Mikrozentrifuge (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur (22 °C) und verteilen Sie dann 50-100 μl mit einem geeigneten Selektionsmittel (50 mg/l Kanamycin für das in diesem Protokoll verwendete Plasmid) auf einer LB-Agarplatte. Nachdem die Zellen 2 Tage bei 28 °C inkubiert haben, werden positive Kolonien, die das interessierende Gen enthalten, mit Hilfe der Kolonie-PCR identifiziert. Verwenden Sie in diesem Protokoll die in Schritt 2.4 genannten Primer und Bedingungen. Verwenden Sie als Nächstes die positiven Kolonien, um eine Vorratsplatte mit LB-Agarmedien + Auswahl zu streifen. Die Platte kann bei 4 °C bis zu 1 Monat gelagert werden. Alternativ kann für die Langzeitlagerung eine positive Kolonie mit einem kleinen Volumen LB mit entsprechender Selektion geimpft werden. Schütteln Sie die beimpfte Kultur über Nacht bei 28 °C bei 200 U/min und bereiten Sie dann eine Glycerinbrühe (50 % w/v Glycerin in einer 50:50-Mischung aus Bakterien und Glycerin) zu, die bei -80 °C bis zu 10 Jahre gelagert werden kann. 4. A . tumefaciens Präparat Streak A. tumefaciens mit dem gewünschten Plasmid auf präparierte 95 mm x 100 mm große feste LB-Platten mit dem entsprechenden Selektionsmittel. In diesem Protokoll wurde der Bakterienstamm GV3101 mit dem Plasmideinsatz AtPP2:GUS verwendet, wobei 50 mg/L Kanamycin für die Selektion hinzugefügt wurden. Versiegeln Sie die Platten mit Paraffinfolie und inkubieren Sie sie dann bei 28 °C für bis zu 48 Stunden oder bis die Bakterien groß genug sind, um sie zu pflücken. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um 2 Tage vor der Transformation eine Bakterienkolonie zu entnehmen, und beimpfen Sie sie in einem 15-ml-Röhrchen mit rundem Boden, das 6 ml flüssiges LB mit entsprechender Auswahl enthält. Bei 200 U/min in einem 28 °C heißen Tischschüttler über Nacht schütteln, bis OD600 0,6-0,7 erreicht.HINWEIS: Die Platten und die 6-ml-Bakterienimpfung können bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden. Wenn die Bakterien den richtigen OD 600 erreicht haben, verwenden Sie eine Pipette, um A. tumefaciens mit einem Selektionsmittel in einen sterilen Kolben mit100 ml flüssigem LB zu überführen. In der Regel sind 200 μl Bakterien pro 100 ml LB für die Vermehrung geeignet. Bei 200 U/min bei 28 °C über Nacht schütteln, bis OD600 0,6-0,7 erreicht. Übertragen Sie die Bakterien in sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 °C) bei 2.200 x g in einer Tischzentrifuge, um die Bakterien aufzufangen. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Das Bakterienpellet wird in 5 ml flüssiger Suspensionslösung (SS) mit Raumtemperatur (22 °C) (Tabelle 1) durch Pipettieren resuspendiert, dann bis zu 50 ml SS hinzugefügt und mehrmals invertiert, um es zu mischen. Das Bakterium ist nun bereit für die Transformation.Anmerkungen: Das flüssige SS muss innerhalb von 1 Woche nach der Umwandlung frisch zubereitet werden.ACHTUNG: Sämtliches Material, das mit A. tumefaciens in Berührung kommt, muss in einer Mülltonne für biologische Abfälle entsorgt werden. Übrig gebliebene Flüssigkeiten aus Bakterienkulturen können mit Natriumhypochlorit (Bleichmittel) in einer Konzentration von 20 % oder mehr sterilisiert werden. 5. Transformation der Plantago-Wurzeln Wenn die Pflanzen das ideale Stadium für die Transformation erreicht haben (die Sämlinge sind 3 Wochen alt) (Abbildung 1C), verwenden Sie eine sterile Pinzette und eine Schere, um die Wurzeln vom Rest der Pflanze zu trennen (Abbildung 3A). Entsorgen Sie das Blatt- und Stängelmaterial. Übertragen Sie die Wurzelstücke unmittelbar nach dem Schneiden mit einer sterilen Pinzette in sterile Boxen mit sterilem Wasser. Dieser Schritt ermöglicht es den Wurzeln, hydratisiert zu bleiben, während das gesamte Gewebe gesammelt wird. Wenn alle Wurzeln abgeschnitten sind, gießen Sie die A. tumefaciens/SS-Suspension in sterile 150 mm x 15 mm große Einweg-Petrischale. Übertragen Sie die Wurzeln in die A . tumefaciens-Kultur und inokulieren Sie sie mindestens 20 Minuten lang (Abbildung 3B). Verwenden Sie während der Inkubation ein steriles Skalpell mit einer scharfen Klinge, um die Wurzeln in 1 cm große Fragmente zu schneiden und die Primärwurzeln von den Seitenwurzeln zu trennen. Machen Sie dünne, flache Schnitte auf der Oberfläche der Wurzeln, damit die Bakterien die Pflanze infizieren können.Anmerkungen: Wenn Sie es mit einer großen Anzahl von Pflanzen zu tun haben, geben Sie die Wurzelstücke portionsweise in die Bakterienkultur, um sicherzustellen, dass alle Wurzeln während der Inokulation eingetaucht werden. Verwenden Sie nach der Inkubation die sterile Pinzette, um die Wurzelstücke auf sterile Papiertücher zu übertragen, um überschüssige Bakterien zu entfernen. Vermeiden Sie es, die Wurzeln länger als 60 Sekunden auszutrocknen, da dies zu Austrocknung führen und das Wurzelgewebe schädigen kann. Im Idealfall können 10-15 Wurzeln gleichzeitig getrocknet werden (Abbildung 3C). Übertragen Sie die getrockneten Wurzeln in vorbereitete 95 mm x 15 mm Petrischalen mit festem Co-Kulturmedium (Tabelle 1), etwa 10-20 Wurzeln pro Platte, je nach Größe der Wurzeln (Abbildung 3D). Versiegeln Sie die Platten mit zwei Schichten transparenter Plastikfolie und decken Sie sie dann mit Aluminiumfolie ab. Bei Raumtemperatur (22 °C) 3 Tage inkubieren. Dieser Schritt gibt den Bakterien Zeit, die Wurzeln zu infizieren, ohne dass ein Antibiotikum ausgewählt wird (Abbildung 3E). 6. Selektion und Regeneration der gesamten Pflanze Nach der Inkubation in Co-Kulturmedien werden die Wurzelstücke in vorbereitete 95 mm x 15 mm Petrischalen mit festem Spross-Induktionsmedium (SIM) (Tabelle 1) mit Timentin (500 mg/l; siehe Materialtabelle) und geeigneter Antibiotikaauswahl überführt. In diesem Protokoll haben wir Kanamycin (100 mg/L) verwendet.Anmerkungen: Die Unterseite der Wurzeln muss vollständig mit dem Medium in Kontakt kommen. Wurzeln, die die Oberfläche des Mediums nicht berühren, sind zu lang und müssen geschnitten werden, um zu verhindern, dass das Gewebe der Selektion entgeht. Versiegeln Sie die Platten mit zwei Schichten transparenter Plastikfolie und wachsen Sie dann 1 Monat lang unter einer Wachstumslampe (siehe Schritt 1.6 für geeignete Bedingungen) oder bis die Triebe zu erscheinen beginnen.Anmerkungen: In der Regel können die Initialen der Triebe nach 2 Wochen des Wachstums beobachtet werden, und die Triebe sind in der Regel nach 1 Monat sichtbar. Wenn die Pflänzchen 1,5 bis 2,0 cm lang sind (Abbildung 1D), werden sie in vorbereitete sterile Boxen mit festem Wurzelinduktionsmedium umgefüllt (Tabelle 1). Züchten Sie die Pflanzen mehrere Wochen lang unter einer Wachstumslampe (siehe Schritt 1.6 für die Bedingungen), bis sich Wurzeln bilden. Wurzeln sind in der Regel erst nach 1 Woche zu sehen.HINWEIS: Es wird empfohlen, die Wurzeln mehrere Wochen wachsen zu lassen, bevor sie in den Boden ziehen, da Pflanzen mit größeren Wurzelsystemen tendenziell eine höhere Überlebensrate im Boden haben. 7. Transfer des Bodens Wenn das Wurzelsystem groß genug geworden ist, um übertragen zu werden (Abbildung 1E), in der Regel nach 1 Monat des Wachstums, setzen Sie die Pflanzen in 3,5 in quadratische Töpfe mit vorgenässter Allzweckerde (BM7) um. In diesem Protokoll wurde BM7-Rindenmischung verwendet (siehe Materialtabelle).Entfernen Sie jegliches Medium, das an den Wurzeln haftet, indem Sie sie vorsichtig in Wasser waschen.HINWEIS: Die Pflanzen können in einem Gewächshaus bei 800 bis 1400 μmol Photonen m-2 s-2 unter Verwendung von 600 W Natriumhochdrucklampen (siehe Materialtabelle) oder in einer Wachstumskammer bei Raumtemperatur (22 °C) mit kaltweißem Licht bei 50 μmol m-2 s-1, 12 h Tage, zur Reife gebracht werden. Decken Sie die Pflanzen mit einer Plastikabdeckung ab und decken Sie sie dann mit einer durchsichtigen Plastiktüte ab. Dieser Schritt ermöglicht es den Pflanzen, in einer feuchten Umgebung zu bleiben, während sie sich an den Boden anpassen. Entfernen Sie nach ca. 3-5 Tagen die Plastiktüte und entfernen Sie dann langsam den Deckel, um sich an die äußere Umgebung zu gewöhnen.HINWEIS: Abhängig von der Jahreszeit und der Umgebung, in die die Pflanzen gebracht werden, kann die Zeit, die die Pflanzen benötigen, um sich anzupassen, variieren. Es wird empfohlen, die Pflanzen täglich zu kontrollieren und bei Bedarf Wasser in die Töpfe zu geben. Gießen Sie die Pflanzen regelmäßig und fügen Sie bei Bedarf Dünger hinzu. Die Pflanzen können auch in größere Töpfe umgepflanzt werden, um weiter zu wachsen (Abbildung 1F). 8. Histochemische Färbung der β-Glucuronidase (GUS) Herstellung β-Glucuronidase (GUS)-Färbelösung gemäß den veröffentlichten Protokollen15. Wenn die Initialen des Sprosses etwa 0,5-1 cm lang sind, entfernen Sie eine kleine Spitze eines jungen, vollständig expandierten Blattes (<5 mm Länge ist in der Regel ausreichend) und geben Sie sofort 0,5-1 ml GUS-Färbelösung in ein 1,5- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Lösung sollte das Pflanzengewebe vollständig bedecken. Die geöffneten Röhrchen in einen Vakuumexsikkator geben und 5-10 min bei 20-25 kPa vakuumieren. Kleine Bläschen sollten während des Vakuumvorgangs in der Lösung sichtbar sein. Dadurch kann die Lösung in die Zellen der Pflanze gelangen. Lassen Sie die Luft zurück in den Vakuumexsikkator filtern. Schließen Sie die Röhrchen und inkubieren Sie sie bei 37 °C über Nacht (12 h) oder bis die blaue Farbe sichtbar ist.ANMERKUNG: In dieser Studie war die GUS-Aktivität auf das Phloem lokalisiert, was bedeutet, dass bei positiv transformierten Pflanzen die blaue Färbung nur im Phloemgewebe sichtbar sein sollte. Bei Pflanzen ohne das Transgen kommt es nicht zu einer Färbung (Abbildung 4). Um den Fleck besser sichtbar zu machen, stellen Sie die Pflanzen auf 100% Ethanol um, um Chlorophyll zu entfernen. Um die Effizienz des Chlorophyllentfernungsprozesses zu erhöhen, inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 60 °C.Anmerkungen: Das Ethanol muss möglicherweise mehrmals gewechselt werden, bevor das gesamte Chlorophyll entfernt wird, abhängig von der Größe des Blattes, das gefärbt wird.