Manipulación CRISPR placentaria dirigida a ratones en vivo

La placenta es un órgano esencial implicado en el desarrollo del feto. El papel principal de la placenta es proporcionar factores esenciales y regular la transferencia de nutrientes y desechos hacia y desde el feto. Las placentas de mamíferos están compuestas por tejido fetal y materno, que constituye la interfaz fetal-materna y, por lo tanto, la genética de la madre y el feto impactan la función¹. Las anomalías genéticas o la función deteriorada de la placenta pueden alterar drásticamente el desarrollo fetal. Trabajos anteriores han demostrado que la genética y el desarrollo de la placenta están asociados con el desarrollo alterado de sistemas de órganos específicos en el feto. En particular, las anomalías en la placenta están relacionadas con cambios en el cerebro, el corazón y el sistema vascular fetales 2,3,4,5.

El transporte de hormonas, factores de crecimiento y otras moléculas de la placenta al feto juega un papel importante en el desarrollo fetal⁶. Se ha demostrado que alterar la producción placentaria de moléculas específicas puede alterar el neurodesarrollo. La inflamación materna puede aumentar la producción de serotonina al alterar la expresión génica metabólica del triptófano (TRP) en la placenta, lo que posteriormente crea una acumulación de serotonina en el cerebro fetal⁷. Otros estudios han encontrado anomalías placentarias junto con defectos cardíacos. Se cree que las anomalías en la placenta contribuyen a los defectos cardíacos congénitos, el defecto congénito más común en los seres humanos⁸. Un estudio reciente ha identificado varios genes que tienen vías celulares similares tanto en la placenta como en el corazón. Si se interrumpen, estas vías podrían causar defectos en ambos órganos⁹. Los defectos en la placenta pueden exacerbar los defectos cardíacos congénitos. El papel de la genética placentaria y la función en el desarrollo de sistemas específicos de órganos fetales es un campo de estudio emergente.

Los ratones tienen placentas hemocoriales y otras características de las placentas humanas, lo que los convierte en modelos muy útiles para estudiar enfermedades humanas¹. A pesar de la importancia de la placenta, actualmente hay una falta de manipulaciones genéticas in vivo dirigidas. Además, actualmente hay más opciones disponibles para knockouts o knockdowns que manipulaciones de sobreexpresión o ganancia de función en la placenta¹⁰. Hay varias líneas transgénicas que expresan Cre para la manipulación placentaria específica, cada una en diferentes linajes de trofoblastos en diferentes puntos de tiempo. Estos incluyen Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER y Gcm1-Cre 11,12,13,14. Si bien estos transgenes Cre son eficientes, es posible que no sean capaces de manipular algunos genes en puntos de tiempo específicos. Otro método comúnmente utilizado para noquear o sobreexpresar la expresión génica placentaria es la inserción de vectores lentivirales en el cultivo de blastocisto, lo que causa una manipulación genética específica del trofoblasto^15,16. Esta técnica permite un cambio robusto en la expresión génica placentaria al principio del desarrollo. El uso de la interferencia de ARN in vivo se ha utilizado escasamente en la placenta. La inserción de plásmidos de ARNsh se puede realizar de manera similar a la técnica CRIPSR descrita en este artículo. Esto se ha hecho en E13.5 para disminuir con éxito la expresión de PlGF en la placenta, con impactos en la vasculatura cerebral de la descendencia¹⁷.

Además de las técnicas que se utilizan principalmente para knockout o knockdown, la inducción de la sobreexpresión se realiza comúnmente con adenovirus o la inserción de una proteína exógena. Las técnicas utilizadas para la sobreexpresión tienen diferentes tasas de éxito y en su mayoría se han realizado más tarde en la gestación. Para investigar el papel del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) en la función placentaria, se realizó una transferencia génica placentaria mediada por adenovirus para inducir la sobreexpresión del gen IGF-1 ^18,19. Esto se realizó al final de la gestación del ratón en E18.5 mediante inyección placentaria directa. Para proporcionar opciones adicionales y eludir posibles fallos de manipulaciones genéticas placentarias establecidas, como fallos de combinación Cre-Lox, la posible toxicidad de adenovirus y los efectos fuera del objetivo del ARNsh, se puede utilizar la manipulación directa in vivo de CRISPR de la placenta^20,21,22. Este modelo fue desarrollado para abordar la falta de modelos de sobreexpresión y para crear un modelo con flexibilidad.

Esta técnica se basa en el trabajo de Lecuyer et al., en el que los plásmidos shRNA y CRISPR fueron dirigidos directamente in vivo a placentas de ratón para alterar la expresión de PlGF ¹⁷. Esta técnica se puede utilizar para alterar directamente la expresión génica placentaria mediante la manipulación CRISPR en múltiples puntos de tiempo; para este trabajo, se seleccionó E12.5. La placenta ha madurado en este punto y es lo suficientemente grande como para manipularla, lo que permite la inserción de un plásmido CRISPR específico en E12.5, que puede tener un impacto significativo en el desarrollo fetal desde mediados hasta finales del embarazo^23,24. A diferencia de los enfoques transgénicos, pero similares a las inducciones virales o la interferencia de ARN, esta técnica permite la sobreexpresión o el knockout en puntos de tiempo particulares utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado, evitando así posibles alteraciones de la placenta o letalidad embrionaria de cambios anteriores. Como solo unas pocas placentas reciben el plásmido experimental o de control dentro de una camada, el enfoque permite dos tipos de controles internos. Estos controles son los inyectados y electroporados con el plásmido de control adecuado y los que no reciben manipulación directa. Esta técnica se optimizó para crear una sobreexpresión del gen IGF-1 en la placenta del ratón a través de un plásmido CRISPR mediador de activación sinérgico (SAM). Se eligió el gen IGF-1, ya que el IGF-1 es una hormona de crecimiento esencial entregada al feto que se produce principalmente en la placenta antes del nacimiento^25,26. Esta nueva técnica CRISPR dirigida a la placenta permitirá la manipulación directa para ayudar a definir la conexión entre la función placentaria y el desarrollo fetal.