Summary

Muis in vivo placenta-gerichte CRISPR-manipulatie

Published: April 14, 2023
doi:

Summary

Hier beschrijven we een tijdspecifieke methode om kritische ontwikkelingspaden in de placenta van de muis in vivo effectief te manipuleren. Dit wordt uitgevoerd door de injectie en elektroporatie van CRISPR-plasmiden in de placenta’s van zwangere moederdieren op embryonale dag 12.5.

Abstract

De placenta is een essentieel orgaan dat de ontwikkeling van zoogdieren in de baarmoeder reguleert en in stand houdt. De placenta is verantwoordelijk voor de overdracht van voedingsstoffen en afvalstoffen tussen moeder en foetus en de productie en afgifte van groeifactoren en hormonen. Placenta-genetische manipulaties bij muizen zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de specifieke rol van de placenta in de prenatale ontwikkeling. Placenta-specifieke Cre-expressing transgene muizen hebben verschillende effectiviteit, en andere methoden voor placentale genmanipulatie kunnen nuttige alternatieven zijn. Dit artikel beschrijft een techniek om placentale genexpressie direct te veranderen met behulp van CRISPR-genmanipulatie, die kan worden gebruikt om de expressie van gerichte genen te wijzigen. Met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak ondergaan zwangere moederdieren een laparotomie op embryonale dag 12.5 (E12.5) en wordt een CRISPR-plasmide afgeleverd door een glazen micropipette in de individuele placenta’s. Het plasmide wordt na elke injectie onmiddellijk geëlektropoeerd. Na damherstel kunnen de placenta’s en embryo’s zich verder ontwikkelen tot beoordeling op een later tijdstip. De evaluatie van de placenta en nakomelingen na het gebruik van deze techniek kan de rol van tijdspecifieke placentafunctie in de ontwikkeling bepalen. Dit type manipulatie zal een beter begrip mogelijk maken van hoe placentale genetica en functie de foetale groei en ontwikkeling in meerdere ziektecontexten beïnvloeden.

Introduction

De placenta is een essentieel orgaan dat betrokken is bij de ontwikkeling van de foetus. De belangrijkste rol van de placenta is om essentiële factoren te bieden en de overdracht van voedingsstoffen en afval van en naar de foetus te reguleren. Zoogdier placenta’s zijn samengesteld uit zowel foetaal als maternaal weefsel, die de foetale-maternale interface vormen, en dus de genetica van zowel de moeder als de foetus beïnvloeden functie1. Genetische afwijkingen of verminderde functie van de placenta kunnen de foetale ontwikkeling drastisch veranderen. Eerder werk heeft aangetoond dat placentale genetica en ontwikkeling geassocieerd zijn met de veranderde ontwikkeling van specifieke orgaansystemen bij de foetus. Met name afwijkingen in de placenta zijn gekoppeld aan veranderingen in de foetale hersenen, het hart en het vasculaire systeem 2,3,4,5.

Het transport van hormonen, groeifactoren en andere moleculen van de placenta naar de foetus speelt een belangrijke rol in de foetale ontwikkeling6. Het is aangetoond dat het veranderen van de placentaproductie van specifieke moleculen de neurologische ontwikkeling kan veranderen. Maternale ontsteking kan de productie van serotonine verhogen door de metabole genexpressie van tryptofaan (TRP) in de placenta te veranderen, wat vervolgens een accumulatie van serotonine in de foetale hersenen creëert7. Andere studies hebben placenta-afwijkingen gevonden naast hartafwijkingen. Afwijkingen in de placenta worden verondersteld bij te dragen aan aangeboren hartafwijkingen, de meest voorkomende geboorteafwijking bij mensen8. Een recente studie heeft verschillende genen geïdentificeerd die vergelijkbare cellulaire routes hebben in zowel de placenta als het hart. Indien verstoord, kunnen deze paden defecten in beide organen veroorzaken9. De defecten in de placenta kunnen aangeboren hartafwijkingen verergeren. De rol van placentale genetica en functie op de ontwikkeling van specifieke foetale orgaansystemen is een opkomend vakgebied.

Muizen hebben hemochoriale placenta’s en andere kenmerken van menselijke placenta’s, waardoor ze zeer nuttige modellen zijn voor het bestuderen van menselijke ziekten1. Ondanks het belang van de placenta is er momenteel een gebrek aan gerichte in vivo genetische manipulaties. Bovendien zijn er momenteel meer opties beschikbaar voor knock-outs of knockdowns dan overexpressie of gain-of-function-manipulaties in de placenta10. Er zijn verschillende transgene Cre-expressing lijnen voor placenta-specifieke manipulatie, elk in verschillende trofoblastlijnen op verschillende tijdstippen. Deze omvatten Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER en Gcm1-Cre 11,12,13,14. Hoewel deze Cre-transgenen efficiënt zijn, zijn ze mogelijk niet in staat om sommige genen op specifieke tijdstippen te manipuleren. Een andere veelgebruikte methode om placentale genexpressie uit te schakelen of te overexpresseren is het inbrengen van lentivirale vectoren in de blastocystcultuur, die een trofoblastspecifieke genetische manipulatie veroorzaakt15,16. Deze techniek zorgt voor een robuuste verandering in de placenta-genexpressie vroeg in de ontwikkeling. Het gebruik van RNA-interferentie in vivo is schaars gebruikt in de placenta. Het inbrengen van shRNA-plasmiden kan op dezelfde manier worden uitgevoerd als de CRIPSR-techniek die in dit artikel wordt beschreven. Dit is gedaan bij E13.5 om met succes de PlGF-expressie in de placenta te verminderen, met gevolgen voor de hersenvasculatuurvan nakomelingen 17.

Naast technieken die voornamelijk worden gebruikt voor knock-out of knockdown, wordt het induceren van overexpressie vaak uitgevoerd met adenovirussen of het inbrengen van een exogene eiwit. De technieken die worden gebruikt voor overexpressie hebben verschillende succespercentages en zijn meestal later in de zwangerschap uitgevoerd. Om de rol van insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1) in de placentafunctie te onderzoeken, werd een adenoviraal-gemedieerde placentale genoverdracht uitgevoerd om de overexpressie van het IGF-1-gen 18,19 te induceren. Dit werd laat in de dracht van de muis uitgevoerd op E18,5 via directe placenta-injectie. Om extra opties te bieden en mogelijke mislukkingen van gevestigde placentale genetische manipulaties te omzeilen, zoals Cre-Lox-combinatiefouten, de mogelijke toxiciteit van adenovirussen en de off-target effecten van shRNA, kan in vivo directe CRISPR-manipulatie van de placenta worden gebruikt20,21,22. Dit model is ontwikkeld om het gebrek aan overexpressiemodellen aan te pakken en een model met flexibiliteit te creëren.

Deze techniek is gebaseerd op het werk van Lecuyer et al., waarin shRNA- en CRISPR-plasmiden in vivo direct op muis-placenta’s werden gericht om de PlGF-expressie te veranderen17. Deze techniek kan worden gebruikt om placentale genexpressie direct te veranderen met behulp van CRISPR-manipulatie op meerdere tijdstippen; voor dit werk is gekozen voor E12.5. De placenta is op dit punt gerijpt en is groot genoeg om te manipuleren, waardoor een specifiek CRISPR-plasmide op E12.5 kan worden ingebracht, wat een aanzienlijke invloed kan hebben op de foetale ontwikkeling van midden tot laat in de zwangerschap23,24. In tegenstelling tot transgene benaderingen, maar vergelijkbaar met virale inducties of RNA-interferentie, maakt deze techniek overexpressie of knock-out op bepaalde tijdstippen mogelijk met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak, waardoor mogelijke verminderde placentatie of embryonale letaliteit van eerdere veranderingen wordt vermeden. Omdat slechts enkele placenta’s het experimentele of controleplasmide in een nest ontvangen, maakt de aanpak twee soorten interne controles mogelijk. Deze controles zijn die geïnjecteerd en geëlektropoeerd met het juiste controleplasmide en die geen directe manipulatie ontvangen. Deze techniek werd geoptimaliseerd om een overexpressie van het IGF-1-gen in de placenta van de muis te creëren via een synergetische activeringsmediator (SAM) CRISPR-plasmide. Het IGF-1-gen werd gekozen, omdat IGF-1 een essentieel groeihormoon is dat aan de foetus wordt afgegeven en dat voornamelijk vóór de geboorte in de placenta wordt geproduceerd25,26. Deze nieuwe placenta-gerichte CRISPR-techniek maakt directe manipulatie mogelijk om het verband tussen de placentafunctie en de foetale ontwikkeling te helpen definiëren.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met en in overeenstemming met de federale regelgeving en het beleid van de Universiteit van Iowa en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Dieren en veehouderij Houd de dieren in een daglichtcyclus van 12 uur met voedsel en water ad libitum. Gebruik CD-1 vrouwelijke muizen in de leeftijd van 8-15 weken. Gebruik de aanwezigheid van een copulatorische plug om E0…

Representative Results

Algemene procedureresultaten (figuur 6)In de studie waren er drie gemanipuleerde groepen. Deze omvatten placenta’s geïnjecteerd met een algemeen CRISPR Cas9-controleplasmide (Cas9 Control), een activeringscontrole CRISPR-plasmide (Act Control) of een IGF-1 SAM-activeringsplasmide (Igf1-OE). De Cas9 Control is beter geschikt voor knock-out plasmiden en de activatiecontrole is beter geschikt voor overexpressie/activatie plasmiden. Om de levensvat…

Discussion

De placenta is een primaire regulator van foetale groei en zoals eerder opgemerkt, kunnen veranderingen in de expressie of functie van placenta-genen de foetale ontwikkeling aanzienlijk beïnvloeden6. Het hier beschreven protocol kan worden gebruikt om een gerichte in vivo CRISPR-manipulatie van de placenta van de muis uit te voeren met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak. Deze techniek zorgt voor een aanzienlijke opbrengst van levensvatbare embryo’s en hun bijbehoren…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen: R01 MH122435, NIH T32GM008629 en NIH T32GM145441. De auteurs bedanken Dr. Val Sheffield en Dr. Calvin Carter’s laboratoria aan de Universiteit van Iowa voor het gebruik van hun operatiekamer en apparatuur, evenals Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan en Dr. Matthew Weber voor hun hulp bij microscopie. De auteurs bedanken ook Dr. Sara Maurer, Maya Evans en Sreelekha Kundu voor hun hulp bij de pilootoperaties.

Materials

1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD – Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 – 44 – 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24×60 Leica 3800160
Syringes BD – Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Play Video

Cite This Article
Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

View Video