Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation

Die Plazenta ist ein wesentliches Organ, das an der Entwicklung des Fötus beteiligt ist. Die Hauptaufgabe der Plazenta besteht darin, wesentliche Faktoren bereitzustellen und den Transfer von Nährstoffen und Abfallstoffen zum und vom Fötus zu regulieren. Die Plazenta von Säugetieren besteht sowohl aus fötalem als auch aus mütterlichem Gewebe, die die Schnittstelle zwischen Fötus und Mutter bilden, und so wirkt sich die Genetik sowohl der Mutter als auch des Fötus auf die Funktion^{aus 1}. Genetische Anomalien oder eine gestörte Funktion der Plazenta können die Entwicklung des Fötus drastisch verändern. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Genetik und Entwicklung der Plazenta mit der veränderten Entwicklung bestimmter Organsysteme beim Fötus verbunden ist. Insbesondere Anomalien in der Plazenta sind mit Veränderungen des fetalen Gehirns, des Herzens und des Gefäßsystems verbunden 2,3,4,5.

Der Transport von Hormonen, Wachstumsfaktoren und anderen Molekülen von der Plazenta zum Fötus spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Fötus⁶. Es hat sich gezeigt, dass die Veränderung der Plazentaproduktion bestimmter Moleküle die Neuroentwicklung verändern kann. Eine mütterliche Entzündung kann die Produktion von Serotonin erhöhen, indem sie die metabolische Genexpression von Tryptophan (TRP) in der Plazenta verändert, was in der Folge zu einer Anhäufung von Serotonin im fetalen Gehirn führt⁷. Andere Studien haben neben Herzfehlern auch Plazentaanomalien gefunden. Es wird angenommen, dass Anomalien in der Plazenta zu angeborenen Herzfehlern beitragen, dem häufigsten Geburtsfehler beim Menschen⁸. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat mehrere Gene identifiziert, die sowohl in der Plazenta als auch im Herzen ähnliche zelluläre Signalwege aufweisen. Wenn diese Signalwege gestört sind, können sie zu Defekten in beiden Organen führen⁹. Die Defekte in der Plazenta können angeborene Herzfehler verschlimmern. Die Rolle der Plazentagenetik und -funktion bei der Entwicklung spezifischer fetaler Organsysteme ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet.

Mäuse haben hämochoriale Plazenten und andere Merkmale menschlicher Plazenten, was sie zu sehr nützlichen Modellen für die Erforschung menschlicher Krankheiten macht¹. Trotz der Bedeutung der Plazenta fehlt es derzeit an gezielten in vivo Genmanipulationen. Darüber hinaus stehen derzeit mehr Optionen für Knockouts oder Knockdowns zur Verfügung als für Überexpressions- oder Gain-of-Function-Manipulationen in der Plazenta¹⁰. Es gibt mehrere transgene Cre-exprimierende Linien für plazentaspezifische Manipulationen, jede in verschiedenen Trophoblastenlinien zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Dazu gehören Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER und Gcm1-Cre 11,12,13,14. Obwohl diese Cre-Transgene effizient sind, sind sie möglicherweise nicht in der Lage, einige Gene zu bestimmten Zeitpunkten zu manipulieren. Eine weitere häufig verwendete Methode, um die plazentare Genexpression entweder auszuknocken oder zu überexprimieren, ist die Insertion lentiviraler Vektoren in die Blastozystenkultur, was zu einer trophoblastenspezifischen genetischen Manipulation führt^15,16. Diese Technik ermöglicht eine robuste Veränderung der Plazenta-Genexpression in einem frühen Entwicklungsstadium. Die Verwendung von RNA-Interferenz in vivo wurde in der Plazenta nur spärlich genutzt. Die Insertion von shRNA-Plasmiden kann ähnlich wie die in dieser Arbeit beschriebene CRIPSR-Technik durchgeführt werden. Dies wurde bei E13.5 durchgeführt, um die PlGF-Expression in der Plazenta erfolgreich zu verringern, mit Auswirkungen auf das Gehirnsystem der Nachkommen¹⁷.

Zusätzlich zu Techniken, die in erster Linie für Knockout oder Knockdown verwendet werden, wird die Induktion einer Überexpression häufig mit Adenoviren oder der Insertion eines exogenen Proteins durchgeführt. Die Techniken, die für die Überexpression verwendet werden, haben unterschiedliche Erfolgsraten und wurden meist später in der Trächtigkeit durchgeführt. Um die Rolle des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1) in der Plazentafunktion zu untersuchen, wurde ein adenoviral vermittelter Plazenta-Gentransfer durchgeführt, um die Überexpression des IGF-1-Gens zu induzieren^18,19. Dies wurde spät in der Trächtigkeit der Maus auf E18.5 mittels direkter Plazentainjektion durchgeführt. Um zusätzliche Optionen bereitzustellen und mögliche Misserfolge etablierter plazentagenetischer Manipulationen, wie z. B. Cre-Lox-Kombinationsfehler, die mögliche Toxizität von Adenoviren und die Off-Target-Effekte von shRNA, zu umgehen, kann in vivo die direkte CRISPR-Manipulation der Plazenta verwendet werden^20,21,22. Dieses Modell wurde entwickelt, um das Fehlen von Überexpressionsmodellen zu beheben und ein Modell mit Flexibilität zu erstellen.

Diese Technik basiert auf der Arbeit von Lecuyer et al., in der shRNA- und CRISPR-Plasmide direkt in vivo auf die Plazenta der Maus gerichtet wurden, um die PlGF-Expression ^{zu verändern 17}. Diese Technik kann verwendet werden, um die Plazenta-Genexpression durch CRISPR-Manipulation zu mehreren Zeitpunkten direkt zu verändern. für diese Arbeit wurde E12.5 ausgewählt. Die Plazenta ist zu diesem Zeitpunkt gereift und groß genug, um sie zu manipulieren, was die Insertion eines spezifischen CRISPR-Plasmids auf E12.5 ermöglicht, was einen erheblichen Einfluss auf die fetale Entwicklung von der mittleren bis zur späten Schwangerschaft haben kann^23,24. Im Gegensatz zu transgenen Ansätzen, aber ähnlich wie bei viralen Induktionen oder RNA-Interferenzen, ermöglicht diese Technik eine Überexpression oder einen Knockout zu bestimmten Zeitpunkten mit einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz, wodurch eine mögliche Beeinträchtigung der Plazentation oder embryonale Letalität durch frühere Veränderungen vermieden wird. Da nur wenige Plazenten das Versuchs- oder Kontrollplasmid innerhalb eines Wurfes erhalten, erlaubt der Ansatz zwei Arten von internen Kontrollen. Bei diesen Kontrollen handelt es sich um solche, die mit dem entsprechenden Kontrollplasmid injiziert und elektroporiert werden, und solche, die keine direkte Manipulation erhalten. Diese Technik wurde optimiert, um eine Überexpression des IGF-1-Gens in der Mausplazenta über ein synergistisches Aktivierungsmediator (SAM) CRISPR-Plasmid zu erzeugen. Die Wahl fiel auf das IGF-1-Gen, da es sich bei IGF-1 um ein essentielles Wachstumshormon handelt, das dem Fötus zugeführt wird und vor der Geburt hauptsächlich in der Plazenta produziert wird^25,26. Diese neue, auf die Plazenta ausgerichtete CRISPR-Technik wird eine direkte Manipulation ermöglichen, um den Zusammenhang zwischen Plazentafunktion und fetaler Entwicklung zu definieren.